[發明專利]用于預防人或動物慢性弓形蟲病的DNA疫苗

有效

• 申請號: 201310201888.0
• 申請日: 2013-05-27
• 公開（公告）號: CN103251960A
• 公開（公告）日: 2013-08-21
• 發明（設計）人: 叢華;張敏;袁泉;叢海滋;趙玲瀟
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K39/002;A61P33/02;C12N15/30;C12N15/79
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 彭成

技術領域

本發明涉及一種基于弓形蟲緩殖子抗原，用于預防人或動物慢性弓形蟲病的DNA疫苗。

背景技術

弓形蟲(Toxoplasma?gondii)是世界性分布的寄生原蟲，廣泛寄生于人體及動物的有核細胞內，引起嚴重的人獸共患病。人食用被包囊污染的生的或未煮熟的肉以后，緩殖子會侵入腸上皮細胞，分化成快速增長的速殖子的形式，并傳播到整個身體造成嚴重的急性癥狀。而包囊會規律的破裂或裂解宿主細胞并再次入侵其他細胞。由此在導致的慢性感染的宿主大腦中引起強烈的炎癥反應進而形成膠質結節，宿主終身攜帶，可引起腦炎、癲癇和精神異常。因此，研制針對緩殖子時期抗原的新疫苗是非常迫切和必要的。

SAG2C，-2D，-2X主要表達于弓形蟲的緩殖子上的特異性表面抗原，對于弓形蟲包囊的形成有重要的作用。在這項研究中，我們構建了真核表達質粒pVAX1-SAG2C，pVAX1-2D，pVAX1-2X?DNA疫苗，并觀察這些DNA疫苗單獨或混合肌肉注射免疫BALB/c小鼠的免疫原性和小鼠抗PRU株弓形蟲（II型株，易形成包囊的蟲株）攻擊的保護效果。

發明內容

針對上述現有技術，本發明提供了一類編碼弓形蟲緩殖子特異性表面抗原SAG2CDX的DNA疫苗，可用于預防人或動物慢性弓形蟲病的DNA疫苗。

本發明是通過以下技術方案實現的：

用于預防人或動物慢性弓形蟲病的DNA疫苗，將弓形蟲緩殖子上的三個抗原基因SAG2C（序列如序列表中序列1所示）、SAG2D（序列如序列表中序列2所示）和SAG2X（序列如序列表中序列3所示）分別插入到真核載體pVAX1上，獲得重組質粒pVAX1-SAG2C,pVAX1-SAG2D,pVAX1-SAG2X，這三種重組質粒單獨構成重組DNA疫苗或將三種重組質粒混合后獲得重組DNA疫苗。本發明的疫苗，可用于預防人或動物弓形蟲慢性感染，控制宿主腦組織中包囊形成的有效候選疫苗。

本發明的編碼弓形蟲緩殖子特異性表面抗原SAG2C，SAG2D，SAG2X的DNA疫苗，疫苗采用單獨或混合的形式對BALB/c小鼠進行肌肉注射免疫。通過測定細胞和體液免疫反應指標來評價疫苗的免疫原性，通過計數弓形蟲攻擊實驗后小鼠大腦中包囊的數量來評估疫苗的免疫保護性。結果表明與對照組相比，各種DNA疫苗均能有效的加強體液免疫和細胞免疫反應，尤其是混合免疫組，更能有效地降低免疫小鼠在弓形蟲PRU株（II型）攻擊后大腦包囊的形成率。本發明的突出效果是：該疫苗可作為控制弓形蟲慢性感染過程中腦組織包囊形成的有效的候選疫苗。

本發明的疫苗，評估該疫苗的的免疫原性的方式為：將DNA疫苗經肌肉注射免疫BALB/c小鼠2次，間隔3周，分別于第1次免疫前和免疫后2周，第2次免疫后2周和4周，于免疫鼠眼內眥靜脈取血，分離血清，通過測定血樣中的IgG及細胞因子來評估該疫苗的的免疫原性。

本發明的疫苗，評估該疫苗的的免疫保護性的方式為：小鼠于末次免疫后4周，用II型弓形蟲PRU蟲株包囊30個攻擊。8周后處死小鼠，無菌條件下取腦，物理研磨制備腦組織勻漿液。顯微鏡下包囊計數。通過比較實驗組和對照組小鼠腦的包囊數來評價疫苗的免疫保護性。

本發明是針對編碼特異性表達在緩殖子時期的抗原基因疫苗，目的在于減少腦組織內包囊的形成。另外，攻擊實驗所選擇的弓形蟲蟲株是弓形蟲II型弱毒株PRU株，其在宿主體內容易形成包囊，采用經口給予30個包囊來模擬弓形蟲慢性感染過程。

附圖說明

圖1：編碼弓形蟲緩殖子SAG2CDX的DNA疫苗的構建。以弓形蟲基因組獲作為DNA模板，通過聚合酶鏈反應擴增獲得SAG2C,SAG2D,SAG2X基因片段,并插入載體pVAX1的BamHⅠ和Xba?Ⅰ位點間,產生pVAX1-SAG2C，pVAX1-SAG2D，pVAX1-SAG2X。

圖2：重組質粒的凝膠電泳成像示意圖，其中，A：pVAX1/SAG2C重組質粒的凝膠電泳成像示意圖；B：pVAX1/SAG2D重組質粒的凝膠電泳成像示意圖；C：pVAX1/SAG2X重組質粒的凝膠電泳成像示意圖。凝膠電泳成像顯示由相應限制性內切酶消化的重組質粒。