[發明專利]一種二氯喹啉酸降解菌及其應用

有效

• 申請號: 201310201538.4
• 申請日: 2013-05-27
• 公開（公告）號: CN103243060A
• 公開（公告）日: 2013-08-14
• 發明（設計）人: 柏連陽;羅坤;董俊宇;周小毛;曾愛平;劉祥英;胡利鋒;劉開林
• 申請（專利權）人: 湖南農業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A62D3/02;C12R1/05
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛

技術領域

本發明屬于環境污染物生物處理技術領域，具體地說，涉及一種降解二氯喹啉酸的細菌，及其在降解二氯喹啉酸和防治煙草受二氯喹啉酸藥害中的應用。

背景技術

二氯喹啉酸（quinclorac），化學名稱：3，7—二氯—8—喹啉羧酸，是德國巴斯夫公司開發的芽前、芽后新型水田除草劑，因其具有用量少、持效期長、對稗草特效等優點而被廣泛應用于農業生產，主要用于稻田防稗草。其結構式如下：

二氯喹啉酸呈酸性，在酸性土壤中降解緩慢，易給后茬敏感作物造成嚴重危害，特別是在水稻與煙草輪作區，土壤中殘留的二氯喹啉酸易對茄科作物煙草生長產生危害，嚴重影響煙葉的產量和質量，目前尚無有效保護煙草受二氯喹啉酸殘留的藥害的方法或藥劑。

目前減輕土壤中二氯喹啉酸污染的主要途徑為光降解和微生物降解。大量研究證明，自然界中存在的多種微生物是降解環境中殘留農藥的重要因素。據報道，呂鎮梅等（應用生態學報，2004，15(4)：605-609）在2004年分離得到一株二氯喹啉酸的高效降解菌（WZ1），經鑒定其屬于洋蔥假單胞菌屬，11d內能將1000mg/L的二氯喹啉酸降解90%；劉華山等（安全與環境學報，2012，2：45-49）于2012年分離得到一株二氯喹啉酸的高效降解菌（HN36），該菌屬于博德特氏菌屬，48h內能將400mg/L的二氯喹啉酸降解96%。但是，對于煙草受到二氯喹啉酸的藥害，并無保護作用。且目前國內外尚未見有關產堿菌屬降解二氯喹啉酸的研究報道。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種能夠降解二氯喹啉酸，并能防治煙草受二氯喹啉酸藥害的產堿菌。

為了實現本發明目的，本發明提供了一株二氯喹啉酸降解菌，經鑒定為產堿菌屬(Alcaligenes?sp.)，編號J3，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼：100101），保藏日期為2013年3月28日，保藏編號為CGMCC?No.7384，其特征在于：該菌為革蘭氏陰性菌，菌落表面光滑，中心凸起，呈淡黃色，圓形，邊緣整齊，不透明；菌體為桿狀，（0.5～1.2）μm×（0.5～2.6）μm；該菌專性好氧，氧化酶試驗及硝酸鹽還原試驗呈陽性，尿素試驗、硝酸鹽產氣試驗、硫化氫試驗及DNA水解試驗呈陰性，不能利用葡萄糖和蔗糖。

所述降解菌經過富集培養-篩選純化得到，具體步驟如下：

1、富集培養：取含有二氯喹啉酸的土壤樣品，加入含100mg/L二氯喹啉酸的無機鹽培養基中，在30℃、180r/min的搖床中振蕩培養一周后，以4%的接種量接入到新鮮滅菌后的無機鹽培養基中，每周轉接1次，二氯喹啉酸濃度按100mg/L梯度遞增，富集培養5次至二氯喹啉酸終濃度為500mg/L；

其中，所述無機鹽培養基為硝酸鈉4g，磷酸二氫鉀1.5g，磷酸氫二鈉0.5g，三氯化鐵0.01g，氯化鈣0.01g，酵母粉0.05g，微量元素母液（EDTA-二鈉0.01g/L，氯化錳39mg/L，硫酸鋅43mg/L，鉬酸鈉36mg/L）10mL。

2、篩選純化：所述降解菌在富集培養后，采用劃線法純化菌株，將分離得到的降解菌接種至LB斜面上，保存于4℃下。

本發明還提供了所述降解菌在降解二氯喹啉酸中的應用。

所述降解二氯喹啉酸的應用，可通過對單菌的降解率進行測定，具體步驟為：將純化后的菌株J3用液體LB培養基活化（24h）后以4%的接種量轉接至二氯喹啉酸度為50mg/L的無機鹽液體培養基中，30℃、150r/min搖床中黑暗條件下培養1周，檢測菌株J3對二氯喹啉酸的降解率。

本發明還提供了所述降解菌防治煙草受二氯喹啉酸藥害中的應用。

將二氯喹啉酸以混土法加入土壤，劑量分別為其田間推薦用量的25%、50%和100%，裝入直徑18cm，高20cm的盆缽。將培育至4～5葉期的煙苗移栽至盆缽中，每缽1株，移栽后用J3菌液進行灌根處理，接菌量為4%（降解菌J3經液體LB培養過夜，OD600=0.42，加8mlJ3菌液于200ml無菌水中，最后加入到盆缽中煙株根部附近）。分別設CK組（不加菌不加藥）、生防組（加菌加藥，二氯喹啉酸用量為田間推薦用量）和藥害組（只加藥不加菌，二氯喹啉酸用量分別為田間推薦用量），每個處理5個重復。