[發明專利]一種豬無機磷吸收關鍵的通道蛋白基因全長cDNA序列

無效

• 申請號: 201310201525.7
• 申請日: 2013-05-27
• 公開（公告）號: CN103233000A
• 公開（公告）日: 2013-08-07
• 發明（設計）人: 方熱軍;項智鋒
• 申請（專利權）人: 湖南農業大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/12;C12Q1/68
• 代理公司: 湖南兆弘專利事務所 43008
• 代理人: 江巨鰲

技術領域

本發明涉及一種在仔豬小腸中表達的磷轉運通道蛋白基因及其核苷酸序列，即豬鈉依賴型磷轉運蛋白(sodium?dependent?phosphate?cotransporter?IIb,NaPi-IIb)的基因及其核苷酸序列，發明屬于動物營養生理學領域。其成果來源于國家自然基金面上項目“豬小腸NPT-IIb調控蛋白的篩選與鑒定”（編號31172218）及“十二五”農村領域國家科技計劃課題（編號2011BAD26B03-2）”。

背景技術

磷是動植物體內的必需礦物元素，它不但是動物骨骼組織的有效成分，而且是其它軟組織和能量代謝過程中必不可少的成分，對代謝功能的正常發揮起著重要的作用。因此，動物必須從飼料中獲取足夠的磷，才能維持正常的生命和生產活動。特別是現代高產品種對磷營養十分敏感，若磷缺乏，即可導致動物生長緩慢甚至停滯，飼料轉化率降低。與此同時，作為一種非再生資源，磷在飼料工業中具有舉足輕重的地位，是繼蛋白質和能量以外的第三種最昂貴的飼料原料。據統計，2012年全年我國配合飼料生產量達11790.2萬噸，按磷酸氫鈣添加量1.2%計，則年消耗量近218萬噸，所占原料費用達32.7億元，但與其形成鮮明對比的是，在養殖業發達的地區，磷污染環境是非常嚴重的問題，已成為一個全球性的難題。例如，在歐洲一些地區（比利時、荷蘭和法國）動物排泄物所導致的P₂O₅量達500kg/ha/年；在我國，以養豬業為例，2012年生豬出欄量達7.14億頭，年豬糞尿排放量達3.14億噸，按排泄物中含磷1.0%計，僅養豬業一項，年向環境排放的磷量就達314萬噸之多，占整個養殖業磷排放量40%以上。而養殖業磷向外環境的過量排放所導致的水體富化、漁業受損、生態破壞及危害人類健康等系列問題日趨嚴重。因此，磷資源的合理、有效利用對解決因過量磷的排泄所導致的環境污染具有重要意義。

畜禽從飼料中攝取磷(Pi)是通過專一的磷轉運通道來完成的，這也是畜禽對磷吸收及利用的關鍵步驟。對Pi轉運通道蛋白的研究最早在酵母中發現，隨后陸續在細菌、真菌、植物及哺乳動物中發現類似通道蛋白。目前研究表明，人及動物中，轉運通道蛋白對Pi的轉運過程存在與鈉離子協同的作用，即必需在鈉離子存在情況下，才能激活通道蛋白對Pi轉運的活性，故稱為鈉依賴型磷轉運。大量的研究表明，小腸是磷吸收的一個重要位點，豬有超過70%的磷在小腸部位吸收。磷在動物腸道中的吸收分為兩種方式：受化學梯度控制的自由擴散方式和鈉依賴性磷轉運的主動運輸方式，且后者為主要形式。目前已明確，主動運輸方式是由一類統稱為鈉依賴II型轉運蛋白所介導完成的，其中NaPi-IIb轉運載體蛋白是發現的位于小腸刷狀緣膜頂膜，唯一參與腸道調節跨膜轉運的鈉依賴型載體蛋白。基因敲除研究表明，與野生型小鼠比較，NaPi-IIb基因敲除小鼠（npt2b^-/-）鈉依賴型磷吸收活性降低90%以上。圍繞NaPi-IIb載體轉運蛋白對磷的轉運、吸收和動態平衡的作用，開展了大量的研究，如不同磷水平對大鼠小腸中NaPi-IIb載體轉運蛋白mRNA表達量和磷的吸收的影響，NaPi-IIb基因缺失小鼠小腸各腸段（十二指腸、空腸、回腸）磷吸收率與野生型比較及人低磷血癥、遺傳性低血磷性佝僂病、小腸NaPi-IIb基因的突變的檢測等，這些研究充分說明NaPi-IIb載體蛋白作為一種關鍵的功能性蛋白調控著腸道中磷的轉運和吸收。

目前，人類及鼠齒類動物研究進展迅速，雖然在多種物種包括人類、小鼠、大鼠、雞、山羊中已分離得到鈉依賴型磷轉運蛋白(NaPi-IIb)，但是豬NaPi-IIb基因的克隆因為傳統實驗技術（比如cDNA文庫篩選技術）實驗周期長、操作步驟繁瑣、費用較高及假陽性率高等原因，研究進展相對較為緩慢。本發明所采用的豬NaPi-IIb基因全長cDNA克隆方法具有周期短、操作步驟簡潔有效及費用低廉等優勢，并且本發明所涉及到的豬鈉依賴型磷轉運蛋白(NaPi-IIb)全長cDNA克隆分離國內外尚屬首次。而豬NaPi-IIb全長cDNA序列是蛋白功能學研究及單克隆抗體制備的必需步驟，也是探明Na-Pi轉運分子機制從而進行豬低磷飼料品牌開發利用的基礎，因此，本發明具有重大的應用價值。

發明內容

本發明的目的就是提供一種豬無機磷吸收關鍵的通道蛋白基因全長cDNA序列。

在本發明中，“分離的”cDNA是指，該DNA或片段已從天然狀態下位于其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組份分開，而且已經與在細胞中伴隨其蛋白質分開。