[發明專利]卡培立肽的制備方法

有效

• 申請號: 201310201075.1
• 申請日: 2013-05-27
• 公開（公告）號: CN103342745A
• 公開（公告）日: 2013-10-09
• 發明（設計）人: 董華建;王曉莉;韓玉;文永均
• 申請（專利權）人: 成都圣諾生物制藥有限公司
• 主分類號: C07K14/58
• 分類號: C07K14/58;C07K1/16;C07K1/06;C07K1/04
• 代理公司: 成都虹橋專利事務所(普通合伙) 51124
• 代理人: 梁鑫

技術領域

本發明屬于多肽藥物制備方法技術領域，特別涉及卡培立肽的制備方法。

背景技術

卡培立肽具有以下的結構：

卡培立肽是由三得利株式會社與宮崎醫科大學共同研究合成、生產的由28個氨基酸構成的α型心房鈉尿肽。藥理學研究結果表明本藥具有擴張血管、利尿作用，臨床試驗結果表明，本藥可減輕心臟前、后負荷，增加心臟輸出量但不影響心率，對急性心力衰竭具有良好的治療作用。

本品是通過刺激心肌伸展，由心室內顆粒合成的，然后通過冠靜脈分布全身，作用于血管平滑肌和腎臟等組織，調節血壓和體內電解質平衡。它是由28個氨基酸組成的一種循環調節激素。實驗證明大白鼠心室內的顆粒也能合成這種物質。臨床試驗證明，本品在血管平滑肌及腎等組織中與GC-A受體結合，活化鳥苷酸環化酶，使環-磷酸鳥苷增多，而引起血管擴張和利尿作用。

給健康男性志愿者本品50μg/kg及100μg/kg靜注，其消失半衰期α相為2.13±0.38分鐘，β相為9.22±1.24分鐘及α相2.31±0.56分鐘，β相10.9±2.37分鐘。給心衰患者0.1μg/(kg·min)，連續給藥60分鐘，消失半衰期α相為2.83±0.63分鐘，β相為25.3±5.12分鐘。

本品臨床適應癥為急性心功能衰竭(包括慢性心衰急性加重)的治療。

國內外關于卡培立肽制備報道很少，中國專利201110347965.4公開了一種固相合成法，以Wang樹脂為起始原料，以Fmoc保護的氨基酸為單體，依次逐個接上氨基酸得到線性卡培立肽肽樹脂，采用固相氧化法氧化卡培立肽樹脂，采用TFA（三氟醋酸）裂解獲得粗品，最后采用反相高效液相色譜法純化，獲得卡培立肽，該方法獲得的產品純度為98.5%，未規定+Gly和-Gly雜質。而中國專利201210353961.1僅公開了一種卡培立肽常規的純化方法，該方法分離純化的產品沒有考慮+Gly和-Gly雜質的分離。

上述制備方法存在以下不足：由于Gly的結構特點，接入Gly時會發生多接入一個Gly或漏接一個Gly的副反應，所以在制備卡培立肽過程中，在接入Gly的時候會產生[+1Gly]-卡培立肽、[-1Gly]-卡培立肽、[+2Gly]-卡培立肽和[-2Gly]-卡培立肽雜質，而這些雜質與主產品極性非常相近，給分離純化造成很大的困難，從而降低了產品總收率和產品純度。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是現有方法制備的卡培立肽雜質多分離純化困難、產品的總收率和純度低。

本發明解決上述技術問題的技術方案是提供一種卡培立肽的制備方法。該制備方法使用了含Gly的保護氨基酸片段為原料，避免了[+1Gly]-卡培立肽、[-1Gly]-卡培立肽、[+2Gly]-卡培立肽和[-2Gly]-卡培立肽雜質的產生。

本發明提供的卡培立肽的制備方法，包括：采用固相多肽合成法制備卡培立肽線性肽樹脂，卡培立肽線性肽樹脂再酸解得到卡培立肽線性肽粗品，卡培立肽線性肽粗品再經氧化后得到卡培立肽粗品，最后卡培立肽粗品純化后得到卡培立肽純品。其中，固相多肽合成法制備卡培立肽線性肽樹脂的步驟為：在Fmoc-Tyr(tBu)-載體樹脂上通過固相偶聯合成法依次接入下列序列中相對應的保護氨基酸或保護氨基酸片段，制備卡培立肽線性肽樹脂：

R-Ser(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-

W-Arg(Pbf)-Met-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-X-Ala-Gln(Trt)-Y(tBu)-

Z-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Phe-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-樹脂；

其中，R為Fmoc、Boc或H；W為Phe-Gly-Gly；X為Ile-Gly；Y為Ser-Gly；Z為Leu-Gly。

優選的，接入W時，對應的保護氨基酸為Fmoc-Phe-Gly-Gly-OH。

優選的，接入X時，對應的保護氨基酸為Fmoc-Ile-Gly-OH。

優選的，接入Y時，對應的保護氨基酸為Fmoc-Ser(tBu)-Gly-OH。

優選的，接入Z時，對應的保護氨基酸為Fmoc-Leu-Gly-OH。

上述卡培立肽的制備方法中，所述的保護氨基酸或保護氨基酸片段的用量為所投料樹脂總摩爾數的1.2～6倍。優選的，所述保護氨基酸或片段的用量所投料樹脂總摩爾數的2.5～3.5倍。