[發明專利]抑制Hmga2基因表達的雙鏈siRNA

無效

• 申請號: 201310200575.3
• 申請日: 2010-11-24
• 公開（公告）號: CN103540593A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發明（設計）人: 王啟釗;刁勇;許瑞安
• 申請（專利權）人: 華僑大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113
• 代理公司: 泉州市文華專利代理有限公司 35205
• 代理人: 張梧邨

本申請是“一種抑制Hmga2基因表達的雙鏈siRNA及其應用”的分案申請，原申請的申請日為2010年11月24日，申請號為：201010575237.4。

技術領域

本發明涉及siRNA雙鏈序列及其應用，尤其是抑制Hmga2基因表達的雙鏈siRNA及其抗腫瘤應用。

背景技術

RNAi是一種在生物體細胞內，由特異的內源性或外源性雙鏈RNA(double?stranded?RNA,dsRNA)誘發其同源mRNA降解的基因沉默機制。RNAi現象是一種進化上保守的抵御轉基因或外來病毒侵犯的防御機制。將與靶基因mRNA存在同源互補序列的dsRNA導入細胞后，能特異性地降解該mRNA，產生相應的功能表型缺失。RNAi首先由Fire等發現于秀麗隱桿線蟲中，他們發現將dsRNA注入線蟲體內后可抑制序列同源基因的表達，并證實這種抑制主要作用于轉錄之后，所以又將RNAi稱為轉錄后基因沉默(PTGS)[Fire?et?al.,1998，FEBS?Lett.2007Jul]。RNAi廣泛存在于生物界，從低等原核生物，到植物、真菌、無脊椎動物，甚至哺乳動物。研究發現對哺乳動物細胞，最有效的是21～23個堿基大小，3’端有兩個突出堿基的siRNA。RNAi是dsRNA介導的轉錄后沉默，具有強大的細胞穿透能力，可在不同細胞間長距離傳遞和維持。RNAi效應具有兩個明顯的特征，特異性和高效性。siRNA的序列專一性要求非常嚴謹，與靶mRNA之間一個堿基錯配都會顯著削弱基因沉默的效果。因此，有效的RNAi依賴于siRNA的準確設計。siRNA的基因沉默效應取決于其靶基因序列的選擇，任一堿基的錯配都會導致RNAi效率減弱甚至喪失，這種高度的序列特異性使其對點突變、序列插入和缺失的選擇性基因沉默具有明顯的藥理作用。siRNA主要通過脂質體轉染、電穿孔、微注射以及質粒、病毒載體導入。RNAi技術發展至今已經超過10年，其在腫瘤中的研究也已經展開，RNAi的靶基因包括癌基因、甲基化相關基因、旁分泌/自分泌環、抗凋亡基因、血管形成相關基因、組織基質金屬蛋白酶家族、細胞周期調控相關基因、癌轉移相關基因、多藥耐藥相關基因等[Phalon?et?al.Expert?Rev?Mol?Med.2010Aug18;12:e26;Vázquez-Vega?et?al.Rev?Invest?Clin.2010;62(1):81-90]。

Hmga2是人Hmga基因家族的3個主要成員之一。HMGA蛋白家族是一類以AT-hooks的高度保守的DNA結合基序和一個酸性拖尾為特征的小分子非組蛋白染色體蛋白。它們通過識別特定的DNA結構而不是一種特異的核苷酸序列來優先地結合到DNA中AT豐富的小溝內。由于HMGA蛋白家族具有通過改變染色體結構而調節很多目的基因表達的能力，使其通常被認為是結構性轉錄因子[Reeveset?al.Environ?Health?Perspect，2000，108(Suppl5)：803-809]。HMGA參與轉錄調節、胚胎形成、分化、致瘤性轉化、病毒基因組的整合和表達等不同的生物學過程。

人的Hmga2基因位于12號染色體的q15區，5個外顯子的跨度接近160kb，蛋白結構由109個氨基酸組成，其中外顯子1、2、3編碼的序列中各含一個AT?hook。外顯子4和5分別編碼連接區和酸性區。這三個堿性八肽的DNA結合基序都能與DNA分子小溝內的AT豐富區結合，因而稱為AT?hook，其核心結構是BBXRGRXB(B代表堿性氨基酸K或R，X是甘氨酸或脯氨酸)。其中基序中間的保守RGR序列在HMGA2與DNA結合中至關重要。盡管單個DNA結合基序的結合特異性不高，但是如果結合其上的DNA存在間隔一定序列的AT豐富區，則由于多個基序與一個DNA分子結合而使親和力大大提高。