[發(fā)明專利]一種睡眠肽融合蛋白及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310199128.0
• 申請日: 2013-05-27
• 公開（公告）號: CN103467604A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發(fā)明（設計）人: 張新國;張春生;李坤
• 申請（專利權）人: 蘭州理工大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;A61K38/17;A61K47/48;A61P25/20
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司 62102
• 代理人: 董斌

技術領域

本發(fā)明涉及用基因工程技術合成的一種新型的長效PHD/PHLD融合蛋白的制備及其應用，包括含有該基因的重組載體，以及用該載體轉化的畢赤酵母宿主。

背景技術

失眠是一種常見病，在社會節(jié)奏加快及競爭加劇的今天，失眠已經成為一種十分普遍的現(xiàn)象。據(jù)國內潘集陽教授的研究資料顯示，中國家庭目前失眠癥的已高達10%~20%。因此，開發(fā)有效、安全的抗失眠藥物，已成為一項迫切的醫(yī)療和社會問題。

臨床常用具有鎮(zhèn)靜催眠作用的化學合成藥物治療失眠。現(xiàn)臨床使用較多的是第二代苯二氮卓類和第三代非苯二氮卓類催眠藥物，該類藥物都不同程度的存在如頭暈、頭痛、困倦，乏力，呼吸抑制，肝功能損傷等不良反應，甚至較嚴重的耐藥性和依賴性，并伴發(fā)反跳失眠現(xiàn)象，臨床亟待更換。

目前國內外有關新一代催眠藥物的研究主要集中在第四代內源性催眠物質的研究上。睡眠肽是美國學者Monnier分離的內源性肽類化合物（Trp-Ah-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser-Gly-Glu），主要是通過體內阿片肽受體發(fā)揮催眠效應。由于睡眠肽療效確切，而且分子量較小，關于人工合成睡眠肽及其更高活性類似物的研究也是目前睡眠肽研究的一個主要的方向。盡管睡眠肽作為一個九肽，其人工合成相對容易，隨著現(xiàn)在多肽合成工藝的成熟，甚至進行產業(yè)化都不存在問題，但是DSIP作為一種低分子量的小肽，其在體內的半衰期極短，體內清除較快，因此進行人工合成的九肽，并不能從根本上解決睡眠肽在臨床的實際應用問題。也有學者將DSIP基因導人大腸桿菌獲得表達，然而，小分子量的肽，表達發(fā)酵后，產物的分離純化極其困難。近年也有Tsuzuki等將其與一系列蛋白酶進行融合表達，并用等電點法分離得到純品，但該方法的成本較高，不僅需要酶切，而且后純化困難，因而在應用上受到限制，用基因工程的方法并沒有解決睡眠肽的實際臨床應用問題。

采用基因工程方法表達PHD/PHLD是一種簡潔有效的途徑。生物工程技術的成熟使得PHD/PHLD在不同工程菌中的表達不存在技術障礙，這一點從國內外文獻中關于其在不同工程菌中的成功表達的報道中不難發(fā)現(xiàn)，但是作為小分子蛋白其表達后往往純化困難，難以實現(xiàn)產業(yè)化，這也是目前該藥的臨床應用主要來源于固相人工合成的主要原因。但是這種方法表達的融合蛋白應用于工業(yè)成本較高。

發(fā)明內容

本發(fā)明目的是提供本發(fā)明一種新型睡眠肽PHD/PHLD融合蛋白的蛋白質序列和基因序列。

本發(fā)明的再一個目的是提供表達本發(fā)明一種新型睡眠肽PHD/PHLD蛋白編碼基因的宿主。本發(fā)明的宿主可以是被重組表達載體或重組表達載體的一部分轉化，含有本發(fā)明的一種新型睡眠肽PHD/PHLD蛋白編碼基因的細菌、酵母、動物細胞或植物細胞以及含有本發(fā)明融合蛋白基因序列的轉基因動、植物；其中優(yōu)選的是酵母，更優(yōu)選的是畢赤酵母，最優(yōu)選的是GS115。

本發(fā)明是一種睡眠肽融合蛋白及其應用，睡眠肽融合蛋白，包括與序列表中SEQ?ID?No:1血清白蛋白或者與血清白蛋白至少85％序列同源的第一區(qū)，連接在血清白蛋白C-末端的與序列表中SEQ?ID?No:2睡眠肽或者與睡眠肽至少85％序列同源的第二區(qū)，和連接在血清白蛋白N-末端的與序列表中SEQ?ID?No:3傳導肽或者與傳導肽至少85％序列同源的第三區(qū),?所述的睡眠肽融合蛋白可以由上述的第一區(qū)，第二區(qū)和第三區(qū)同時連接構成，也可以由上述的第一區(qū)，第二區(qū)和第三區(qū)同時連接，且第一區(qū)與第二區(qū)由鏈接肽連接構成。

?本發(fā)明的睡眠肽融合蛋白，在睡眠障礙疾病及[b1]?治療中的應用。

本發(fā)明提供的一種新型睡眠肽PHD/PHLD融合蛋白適用于畢赤酵母中表達，構建的載體整合至畢赤酵母的基因組中，十分穩(wěn)定，不易丟失。畢赤酵母具有許多高等真菌細胞表達系統(tǒng)所具有的優(yōu)點，能進行蛋白質的加工和折疊，轉錄后的修飾，而且易于大規(guī)模培養(yǎng)，實現(xiàn)高密度發(fā)酵。與其他的表達系統(tǒng)如哺乳動物細胞培養(yǎng)相比具有更簡潔、快速表達和產量更高的優(yōu)點。畢赤酵母能以甲醇為唯一碳源進行代謝，含有是可調控的醇氧化酶強啟動子，重組蛋白表達高。此外，畢赤酵母表達的重組蛋白高效分泌到細胞外的培養(yǎng)液中，避免了由酵母細胞抽提物中分離純化蛋白的難題，不但提高表達蛋白的活性，而且非常有利于重組蛋白的純化，純化步驟簡潔高效，同時酵母分泌的蛋白僅占全部酵母蛋白的很小部分，終產品無毒性，利于臨床使用。