[發(fā)明專利]一種小分子化合物的用途

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310191600.6
• 申請(qǐng)日: 2013-05-22
• 公開（公告）號(hào): CN103361305A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙猛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 趙猛
• 主分類號(hào): C12N5/0735
• 分類號(hào): C12N5/0735
• 代理公司: 廈門市誠(chéng)得知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 35209
• 代理人: 方惠春

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域的干細(xì)胞方向，尤其涉及一種小分子化合物用于促進(jìn)胚胎干細(xì)胞的自我更新且抑制分化的用途并可用于干細(xì)胞培養(yǎng)基。?

背景技術(shù)

現(xiàn)在醫(yī)學(xué)研究的前沿之一是再生醫(yī)學(xué)，它為我們治療不同疾病提供了一個(gè)美好的預(yù)期前景。而干細(xì)胞生物學(xué)無(wú)疑是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最熱門的方向，隨著誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞的成功，為干細(xì)胞進(jìn)入臨床治療提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。但是干細(xì)胞非常不穩(wěn)定且容易分化，受制于干細(xì)胞培養(yǎng)門檻較高，很多單位一直不能開展干細(xì)胞研究和應(yīng)用。因此，建立一種簡(jiǎn)單穩(wěn)定高效低成本的干細(xì)胞培養(yǎng)體系在現(xiàn)今有非常重大的意義。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是：提供一種能很好地維持小鼠胚胎干細(xì)胞的干性，并可以增加小鼠胚胎干細(xì)胞形成克隆的效率的小分子化合物。?

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種小分子化合物CHIR99021用于促進(jìn)胚胎干細(xì)胞的自我更新且抑制分化的用途。?

本發(fā)明的一個(gè)方面提供小分子化合物CHIR99021用于干細(xì)胞培養(yǎng)基成分的用途。?

本發(fā)明的一個(gè)方面提供一種干細(xì)胞培養(yǎng)基，包括小分子化合物CHIR99021。優(yōu)選干細(xì)胞培養(yǎng)基中小分子化合物CHIR99021的濃度為2μM。?

本發(fā)明的一個(gè)方面提供一種促進(jìn)胚胎干細(xì)胞的自我更新且抑制分化的方法，包括將小分子化合物CHIR99021加入到干細(xì)胞培養(yǎng)基中的步驟。?

小分子化合物CHIR99021的中文名稱為6-[2-[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基氨基]乙基氨基]吡啶-3-甲腈，分子式為C₂₂H₁₈C_l2N₈。?

有研究表明CHIR99021和其他干細(xì)胞維持因子（如SU5402，PD184352）共同使用時(shí)可以延長(zhǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞的干性。本發(fā)明通過(guò)大量研究，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用該小分子CHIR99021也能很好地維持小鼠胚胎干細(xì)胞的干性，并可以增加小鼠胚胎干細(xì)胞形成克隆的效率。?

本發(fā)明的申請(qǐng)人從調(diào)控干細(xì)胞生長(zhǎng)分化的通路出發(fā)，篩選可以促進(jìn)干細(xì)胞自我更新的小分子化合物，并通過(guò)與培養(yǎng)體系中其他不同成分（重組人白血病抑制因子LIF）的搭配，發(fā)現(xiàn)了一種高效的干細(xì)胞培養(yǎng)體系，使得小鼠胚胎干細(xì)胞極易形成克隆，并且干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)正常。此干細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立，使得干細(xì)胞培養(yǎng)更為簡(jiǎn)單，為以后干細(xì)胞的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。此干細(xì)胞培養(yǎng)體系，即為在基本培養(yǎng)基中加入小分子化合物CHIR99021。?

具體為本發(fā)明建立了一種新的干細(xì)胞培養(yǎng)體系，在基本培養(yǎng)基中加入小分子化合物CHIR99021后，可以促進(jìn)胚胎干細(xì)胞的自我更新并且抑制分化的作用。申請(qǐng)人調(diào)整了之前常用的干細(xì)胞培養(yǎng)體系，比如DMEM+20%FBS+1×NEAA+1mM?Sodium?pyruvate+200U/ml?LIF+0.05mM?β-Me，添加一種新型的小分子化合物CHIR99021，可以使小鼠胚胎干細(xì)胞克隆形成率達(dá)到95%以上，而且培養(yǎng)兩天不換液也不會(huì)出現(xiàn)干細(xì)胞分化的現(xiàn)象，能很好的維持干細(xì)胞的干性。此培養(yǎng)體系不僅可以培養(yǎng)多種干性難維持的干細(xì)胞系，本培養(yǎng)體系中普通干細(xì)胞系的狀態(tài)也明顯優(yōu)于現(xiàn)有培養(yǎng)體系培養(yǎng)的同類細(xì)胞，可以從附圖1和8可以看出。同時(shí)本體系成本更低，可以廣泛應(yīng)用于今后的干細(xì)胞培養(yǎng)中。?

本實(shí)施例所用的E14細(xì)胞是小鼠胚胎第14天的細(xì)胞。?

本發(fā)明的實(shí)施例提供了兩種不同培養(yǎng)基用于培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞的對(duì)比圖，從圖中可以看出，培養(yǎng)基中單獨(dú)加了CHIR99021之后，克隆數(shù)目和干細(xì)胞特性得到了很好的維持，CHIR99021可使干細(xì)胞克隆形成的效率顯著提高。?

?【附圖說(shuō)明】?

圖1為明場(chǎng)下小鼠胚胎干細(xì)胞克隆圖，培養(yǎng)基中加入了2μM?CHIR99021；（5×）

圖?2為明場(chǎng)下小鼠胚胎干細(xì)胞克隆圖，培養(yǎng)基中未加入CHIR99021；（5×）

圖3為OCT4抗體免疫熒光的小鼠胚胎干細(xì)胞克隆圖，培養(yǎng)基中加入了2μMCHIR99021；（25×）

圖4為DAPI染細(xì)胞核的小鼠胚胎干細(xì)胞克隆圖，培養(yǎng)基中加入了2μMCHIR99021；（25×）

圖5為圖3和圖4的疊合圖。（25×）

圖6為OCT4抗體免疫熒光的小鼠胚胎干細(xì)胞克隆圖，培養(yǎng)基中未加入CHIR99021；（25×）

圖7為DAPI染細(xì)胞核的小鼠胚胎干細(xì)胞克隆圖，培養(yǎng)基中未加入CHIR99021；（25×）