[發明專利]利用酶聯免疫斑點法的結核效應T淋巴細胞檢測方法

無效

• 申請號: 201310190266.2
• 申請日: 2013-05-21
• 公開（公告）號: CN103364545A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發明（設計）人: 戴寧榆;葉愛玲;李思;李貴州
• 申請（專利權）人: 佛山迪安醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

1.利用酶聯免疫斑點法的結核效應T淋巴細胞檢測方法，其特征在于，步驟包括：

A．采集肝素鋰抗凝外周血4-8ml，在1600-1800r/min離心28-30min；向裝有平衡至室溫的4ml的RPMI1640的15ml離心管中倒入4ml肝素鋰抗凝外周血，混勻；按照2-3:1的比例小心將上述血樣加在4ml的Ficoll淋巴細胞分離液上層，確保上述血樣與所述Ficoll淋巴細胞分離液不混合；然后在18℃以2280r/min離心22min；

B．離心后，吸取中間云霧狀的單個核細胞層到15ml離心管中，加入RPMI1640至10ml，混勻，在18℃以1780r/min離心7min；

C．離心后，棄去上清液，加入1ml的RPMI1640輕緩重旋沉淀，再加入RPMI1640至10ml，混勻，在18℃以1350r/min離心7min；

D．離心后，棄去上清液，加入0.5-1ml的AIM-V培養液輕緩重旋沉淀制成樣品細胞懸液；

E．制備稀釋細胞工作液：

在1.5ml離心管中加入10μl樣品細胞懸液和40μl的0.4%的臺酚蘭，混勻，取10μl臺酚蘭和樣品細胞懸液的混合物加入血細胞計數板中計算每ml的樣品細胞懸液的細胞數量，計數4×4大格含0.1μl樣品；

然后計算細胞稀釋需要的體積，并加入AIM-V無血清培養液；

按照公式：需要的樣品細胞懸液量=（每個培養孔需要加入的細胞數量×10^-5×需要使用的稀釋細胞工作液量）/（每ml的樣品細胞懸液的細胞數量×10^-6）；

每ml的樣品細胞懸液的細胞數量=細胞計數×稀釋倍數×10⁴；

需要使用的稀釋細胞工作液量=需加入的孔位數×100μl＋100μl；

AIM-V無血清培養液量=需要使用的稀釋細胞工作液量-需要的樣品細胞懸液量；

F．向培養板中加入AIM-V培養液、抗原A、抗原B、陽性對照各50μl至培養板中的陰性對照孔、抗原A孔、抗原B孔、陽性對照孔中，再往上面4孔中分別加入100μl稀釋細胞工作液，放在37℃的CO2培養箱孵育16-20h；

G.試劑平衡至室溫，用無菌PBS按1:200配制酶標抗體工作液，現配現用，即酶標抗體工作液=需要的孔位數×50μl＋100μl；

H.取出培養板，棄去孔內液體，用200μl新鮮準備的無菌PBS洗滌4遍，每洗完一次用拍板紙拍干，用加入50μl新鮮配制的酶標抗體工作液，將培養板放2-8℃冰箱孵育1h；

I.取出培養板，用200μl新鮮準備的無菌PBS洗滌4遍，每洗完一次用拍板紙拍干，每孔加入底物工作液50μl，室溫避光反應7min，再以蒸餾水沖洗終止反應，放室溫干燥培養板，用放大鏡觀察結果，進行斑點計數。