[發明專利]一種豬視網膜細胞及其應用

無效

• 申請號: 201310189019.0
• 申請日: 2013-05-21
• 公開（公告）號: CN103224911A
• 公開（公告）日: 2013-07-31
• 發明（設計）人: 韓乃軍;鄒敏
• 申請（專利權）人: 青島易邦生物工程有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

技術領域

本發明屬于細胞培養領域，具體涉及一種豬視網膜傳代細胞及其應用。

背景技術

豬圓環病毒病(Porcine?Circovirus?Disease，PCVD)是由PCV2病毒感染而引起的一種臨床癥狀為漸進性消瘦、呼吸困難急促、貧血、腹瀉、黃疸、間質性肺炎、淋巴結炎及腎炎，主要侵害5～12周齡斷奶仔豬，與近年來發生的?PMWS、豬皮炎與腎炎綜合征（Porcine?Dermatitis?and?Nephropathy?Syndrome,?PDNS）、豬呼吸道綜合征(Porcine?Respiratory?Disease?Complex,?PRDC)、A2型先天性振顫(Congenital?Tremor,?CT)、豬增生性和壞死性肺炎(Porcine?Proliferative?and?Necrotizing?Pneumonia,?PNP)、繁殖障礙等疾病都有密切相關。PCV2的危害在于能夠使感染豬只的免疫功能受到損害，導致機體抵抗力下降，并經常以亞臨床感染的形式出現，易被忽視。由于PCV2感染使免疫系統受到損害，容易繼發或并發其它病原體，使病情加重，并造成更大危害。本病呈世界性流行，自2000年證實我國存在此病以來，現已在我國豬群中普遍存在，給我國養豬業造成相當大的經濟損失。

研究發現，豬圓環病毒2型（以下簡稱PCV2）能在單核細胞、肝細胞、心肌細胞以及腎上皮細胞等原代細胞中繁殖，也能在Vero等傳代上皮細胞中繁殖，但觀察不到細胞病變，只有在豬視網膜上皮細胞內繁殖能使細胞產生明顯的病變。而原代豬視網膜上皮細胞有分裂次數限制，體外培養20幾代以后細胞就會自然衰老死亡。因此需要構建一株能連續傳代的豬視網膜上皮細胞，以供PCV2的分離、培養、鑒定。

發明內容

本發明的目的是提供一種豬視網膜上皮細胞，以供PCV2病毒的分離和鑒定，從而彌補現有技術的不足。

本發明將含有LTAg基因的質粒轉入到原代豬視網膜上皮細胞中建立了傳代豬視網膜細胞MPR，該細胞可以連續傳代培養，培養至80代時細胞形態和性狀均未發生改變。PCV2病毒可以在該細胞內大量增殖，并引起明顯的細胞病變。

本發明的一個方面涉及一個轉基因傳代豬視網膜上皮細胞MPR，其保藏編號為：CCTCC?NO:?C2012193，保藏單位：中國典型培養物保藏中心。保藏單位地址:?湖北省武漢市武漢大學，保藏日期：2012年12月13日。

本發明的細胞的構建，是將表達SV40病毒大T抗原LTAg基因和新霉素抗性（neomycin?resistance）基因的質粒轉入豬視網膜上皮細胞中構建的。

所述的質粒為質粒pcDNA3.1-LTAg，其啟動子為CMV（人巨細胞病毒）。

本發明豬視網膜上皮細胞MPR的應用，用于PCV2病毒的分離、培養以及鑒定。

本發明的MPR細胞與原代豬視網膜上皮細胞形態無變化，能連續穩定傳代至80代以上。經western?blot和RT-PCR檢測，MPR細胞能持續穩定表達LTAg，第80代細胞仍能檢測出LATg的穩定表達。因此，本發明的MPR細胞在PCV2病毒的分離、培養以及鑒定中具有很好的應用前景。

具體實施方式

本發明將1個LTAg表達質粒穩定轉染到豬視網膜上皮細胞中,經過長期的篩選獲得了能夠穩定遺傳的傳代細胞，并建立了PCV2病毒的培養方法。

轉入豬視網膜上皮細胞中的pcDNA3.1-LTAg質粒是由pcDNA3.1(+)質粒構建的，在質粒中插入LTAg基因，該基因的表達由CMV（人巨細胞病毒）啟動子驅動。pcDNA3.1(+)質粒中還含有Neomycin（新霉素）抗性基因，因此可以用藥物G418來篩選能穩定表達LTAg的細胞。經G418壓力篩選得到能穩定表達LATg，并能連續傳代、性狀穩定的豬視網膜上皮細胞MPR。MPR細胞接PCV2病毒72小時能觀察到明顯的細胞病變，并且病毒滴度能達到6.5。

實施例1???LTAg表達質粒pcDNA3.1-LTAg的構建