[發明專利]一種制備b型流感嗜血桿菌多糖結合疫苗的方法

有效

• 申請號: 201310188248.0
• 申請日: 2013-05-20
• 公開（公告）號: CN103251943A
• 公開（公告）日: 2013-08-21
• 發明（設計）人: 李洪光;伍長華;關曉峰;吳強;吳畏
• 申請（專利權）人: 成都歐林生物科技股份有限公司
• 主分類號: A61K39/385
• 分類號: A61K39/385;A61K39/102;A61P31/04;C08B37/00
• 代理公司: 成都金英專利代理事務所(普通合伙) 51218
• 代理人: 袁英

技術領域

本發明涉及疫苗制備方法技術領域，特別是一種制備b型流感嗜血桿菌多糖結合疫苗的方法。

背景技術

流感嗜血桿菌（Haemophilus?Influenza，Hi）迄今仍是導致人類侵襲性疾病的主要致病菌，其中絕大部分由b型流感嗜血桿菌（Haemophilus?Influenza?type?b，Hib）引起。Hib腦膜炎居細菌性腦膜炎的首位，具有發病率高、病死率高和致殘率高的特點；其另一個特點是發病年齡小，嬰幼兒感染率高，發病年齡主要集中在5歲以下，尤其是2歲以下。全世界估計每年至少造成300萬例嚴重疾病，其中約38.6萬人死亡，已成為全球性的一大公共衛生問題。在發展中國家，Hib肺炎在兒童感染性疾病中占有重要地位，約占所有兒童肺炎的20%，是發展中國家兒童肺炎的重要死亡原因。在亞洲22個國家的48項研究中，有2/3表明Hib是兒童非結核性腦膜炎的首要致病原。

我國3～5歲兒童中Hib自然感染抗體水平低，為Hib感染高危人群。因此，我國有使用Hib疫苗的必要。接種疫苗是預防絕大多數Hib嚴重病例的唯一公共衛生措施。第一種Hib多糖疫苗于1985年4月在美國上市，這種疫苗適用于2～5歲的兒童。對于小于18月齡的兒童，這種采用PRP的疫苗的有效率實際為零，成為這種疫苗使用上的最大的障礙。流行病學調查表明6月齡前兒童就需要保護。

結合疫苗的研制成功解決了疫苗在嬰幼兒中無效的問題。結合疫苗比以往的疫苗具有更強的免疫原性和更好的免疫效果。結合疫苗于1987年投放市場，針對18月齡以上兒童。在隨后幾年間，三種新的疫苗很快面市，采用了不同的蛋白作為結合蛋白。這些新疫苗在嬰幼兒中非常有效。即使在小年齡嬰兒中使用Hib疫苗，也是安全有效的。

在Hib結合疫苗制備的過程中，目前普遍運用的制備方法是：利用液體發酵的方法制備Hib菌液，殺菌后再經CDAP沉淀、乙醇沉淀、冷酚抽提、無水乙醇和丙酮洗滌等步驟獲得精制Hib莢膜多糖，再用CNBr活化Hib莢膜多糖后連接己二酰肼，然后在碳二亞胺的催化作用下Hib莢膜多糖通過己二酰肼的橋連作用與載體蛋白結合，最后經凝膠過濾層析純化收集高分子多糖蛋白結合物，即為多糖蛋白結合疫苗原液。

但因制備的精制Hib莢膜多糖中存在大量分子量低于700kd的小分子多糖，這部分多糖與載體蛋白結合后分子量小，經凝膠過濾層析后被分離出去了，導致結合過程中，高分子多糖蛋白結合物的收率很低，目前業內該制備方法的Hib莢膜多糖多糖收率僅4～6%。另外因制備過程中獲得的精制Hib莢膜多糖的分子大小分布不均，每個批次的分子大小分布存在較大差異，導致每批多糖蛋白結合疫苗原液的理化指標各異，影響生產工藝的穩定性、成品疫苗的批間穩定性和成品疫苗質量的一致性。

凝膠過濾層析也稱分子篩層析、排阻層析，是利用具有網狀結構的凝膠的分子篩作用，根據被分離物質的分子大小不同來進行分離。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網狀結構物質，多是交聯的聚糖（如葡聚糖或瓊脂糖）類物質，小分子物質能進入其內部，流下時路程較長，而大分子物質卻被排除在外部，下來的路程短，當一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質就按不同分子量篩分開了。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的缺點，提供一種降低原料消耗、提高工藝穩定性、產品一致性的制備b型流感嗜血桿菌多糖結合疫苗的方法。

本發明的目的通過以下技術方案來實現：一種制備b型流感嗜血桿菌多糖結合疫苗的方法，它包括以下步驟：

S1、多糖的凝膠過濾層析純化，將Hib莢膜多糖用注射用水稀釋成濃度為3～6mg/ml的溶液，用孔徑0.45μm的濾膜澄清過濾，濾液經Sepharose4FF凝膠層析柱層析純化，收集KD≤0.3的層析洗脫液，收集的洗脫液再用300KD超濾膜超濾濃縮至多糖濃度≥4mg/ml，即得大分子Hib莢膜多糖；

S2、多糖-TT結合物的制備，它包括以下子步驟：

S21、將大分子Hib莢膜多糖溶液用注射用水稀釋成2～4mg/ml的溶液，向該溶液中加入CNBr活化15～25分鐘，加入的CNBr與多糖重量比為0.5～1:1；再加入己二酰肼進行10～20分鐘衍化反應，加入的己二酰肼與多糖的重量比為3～5：1；反應物經300KD超濾膜反復用注射用水稀釋、超濾濃縮，去掉殘余CNBr，得到多糖-AH衍生物；