[發(fā)明專利]基于FK506生產(chǎn)菌筑波鏈霉菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型指導(dǎo)下次級途徑改造方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310187310.4
• 申請日: 2013-05-20
• 公開（公告）號: CN103279689A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 聞建平;黃笛;夏夢雷
• 申請（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號: G06F19/12
• 分類號: G06F19/12
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 王麗

1.一種基于FK506生產(chǎn)菌筑波鏈霉菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型指導(dǎo)下次級途徑改造方法，其特征步驟如下：

1)模型基于注釋基因和生理生化信息，通過與天藍色鏈霉菌（Streptomyces?coelicolor）基因組比較分析，發(fā)現(xiàn)代謝基因是高度保守的；

2)對基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)進行代謝通量分析，模型預(yù)測了提高生產(chǎn)水平的突變菌次級途徑基因簇改造策略。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：以蛋白胨、酵母提取物和黃豆餅粉為氨基酸唯一氮源。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：按照f_PH的計算公式篩選FK506生物合成的次級途徑擴增靶基因，fPH≡(fbiomass)(fFK506)=(vbiomass,overexpressionvbiomass,wild)(vFK506,overexpressionvFK506,wild).]]>

4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于FK506生物合成的次級途徑擴增靶基因為fkbO、fkbL、fkbP、fkbM和fkbD。

5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：FK506生物合成的次級途徑擴增靶基因簇改造策略是擴增分支酸水合還原酶、賴氨酸環(huán)化酶、NRPS肽合酶、C9羥基化酶和C31甲基化酶。

6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征是FK506生物合成的次級途徑擴增靶基因步驟如下：

1）對次級途徑基因fkbO、fkbL、fkbP、fkbM和fkbD進行基因擴增；

2）將基因改造菌株進行搖瓶前體補料培養(yǎng)，考察菌株改造前后FK506產(chǎn)量變化。

7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：對預(yù)測出的關(guān)鍵基因，采用基因擴增的分子改造方法，構(gòu)建擴增質(zhì)粒pFKBO、pFKBL、pFKBP、pFKBM和pFKBD，將含目標基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌ET12567，利用接合轉(zhuǎn)移方法轉(zhuǎn)入筑波鏈霉菌D852中，利用安普霉素抗性篩選和PCR驗證方法獲得基因擴增菌株HT-FKBO、HT-FKBL、HT-FKBP、HT-FKBM和HT-FKBD。

8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：對改造的菌株進行搖瓶前體補料發(fā)酵培養(yǎng)，在搖瓶中28℃、220rpm培養(yǎng)168小時；產(chǎn)量比野生型提高了20%-90%；使用的培養(yǎng)基組成為：淀粉60g/L，酵母提取物2g/L，蛋白胨2.5g/L，黃豆餅粉5g/L，K₂HPO₄0.5g/L，CaCO₃0.5g/L，MgSO₄0.5g/L，pH6.8，豆油和乳酸分別以5g/L和15g/L的終濃度于24h和36h添加，莽草酸、分支酸、賴氨酸和哌克酸分別以0.5g/L、0.25g/L、1.0g/L和0.25g/L的終濃度于48h添加，琥珀酸、異亮氨酸和纈氨酸分別以1.5g/L、1.0g/L和1.5g/L的終濃度于96h添加。