[發(fā)明專利]一種牛乳鐵蛋白定量檢測試劑盒及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310187213.5
• 申請日: 2013-05-17
• 公開（公告）號: CN103267822A
• 公開（公告）日: 2013-08-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 任一平;張京順;賴世云;蔡增軒;徐小民
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省疾病預(yù)防控制中心
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

（一）技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種牛乳鐵蛋白定量檢測試劑盒及其應(yīng)用。

（二）背景技術(shù)

牛乳鐵蛋白（Bovine?Lactoferrin）分子的主體是由689個氨基酸殘基組成的鐵離子結(jié)合性單鏈糖蛋白，含有2個鐵結(jié)合部位，具有可逆的鐵結(jié)合特性，鐵結(jié)合的乳鐵蛋白隨pH的降低而釋放鐵離子。通常，糖基化和鐵結(jié)合率的不同會使不同狀態(tài)和來源的乳鐵蛋白的相對分子量有所差異，總體介于75～82.6kDa之間。牛乳鐵蛋白與人乳中的乳鐵蛋白的氨基酸組成比較相近，約有70%的氨基酸序列一致，且兩者的鐵結(jié)合能力相差不大，分別為93%和95%。乳鐵蛋白作為一種新型的天然營養(yǎng)蛋白質(zhì)，含有人體所需的多種氨基酸，具有廣泛的生物學(xué)活性。其主要營養(yǎng)價值作用是與鐵離子具有良好的可逆結(jié)合能力，能夠促進兒童與婦女對鐵的吸收率。此外乳鐵蛋白可以奪走細(xì)菌生長所需的鐵而抑制細(xì)菌生長繁殖，從而可以作為一種廣譜抗菌劑。乳鐵蛋白的生物學(xué)功能還包括提高機體免疫力、抗炎、抑制腫瘤細(xì)胞生長等。目前，乳鐵蛋白已被公認(rèn)為是一種新型抗菌、抗癌藥物和極具開發(fā)潛力的食品、化妝品添加劑，美國食品藥品管理局批準(zhǔn)將其作為食品添加劑用于運動和功能性食品。近幾年，市場上出現(xiàn)了大量聲稱添加牛乳鐵蛋白的乳制品和配方食品，由于原料復(fù)雜、加工工藝不同等原因造成產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊，但又沒有建立準(zhǔn)確有效的定量檢測方法，其中主要原因是缺少快速有效的可準(zhǔn)確定量檢測的方法。

目前國內(nèi)外用于牛乳鐵蛋白的檢測方法仍以SDS-PAGE法和酶聯(lián)免疫化學(xué)法為主，其中前者為半定量方法，不能進行準(zhǔn)確定量，由于操作繁瑣費時不利于在常規(guī)檢測中進行推廣應(yīng)用；而后者雖然具有良好的檢測靈敏度和特異性，但是檢測成本較高，且容易出現(xiàn)假陽性，不能準(zhǔn)確有效檢測由于生產(chǎn)加工而受到部分破壞的乳鐵蛋白。近年來有研究者嘗試了應(yīng)用HPLC-UV的檢測方法，由于分辨力差而無法用于復(fù)雜基質(zhì)尤其是乳鐵蛋白含量較低的食品檢測；Li?Jia等建立了毛細(xì)管電泳-紫外檢測器的方法測定嬰幼兒配方中的牛乳鐵蛋白，樣品經(jīng)乙酸溶液溶解提取后離心過濾，根據(jù)不同蛋白組分在高壓電場下的毛細(xì)管中的遷移不同而實現(xiàn)分離，采用214nm紫外光波長下進行檢測，但是毛細(xì)管電泳法穩(wěn)定性差、難重現(xiàn)，且只限于試樣中非變性的牛乳鐵蛋白定量的檢測，而無法全面反映食品中乳鐵蛋白的含量，進而無法全面評價產(chǎn)品的質(zhì)量和營養(yǎng)價值。經(jīng)查詢，至今為止還未發(fā)現(xiàn)應(yīng)用同位素內(nèi)標(biāo)肽稀釋法，結(jié)合HPLC-ESI-MS/MS測定乳與乳制品中牛乳鐵蛋白的內(nèi)標(biāo)定量方法。

（三）發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種應(yīng)用同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)肽稀釋法，結(jié)合HPLC-MS/MS可定量測定不同乳及乳制品中牛乳鐵蛋白的試劑盒及其應(yīng)用。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種牛乳鐵蛋白定量檢測試劑盒，主要包括牛乳鐵蛋白特異肽、同位素標(biāo)記牛乳鐵蛋白特異肽和同位素標(biāo)記牛乳鐵蛋白內(nèi)標(biāo)，所述牛乳鐵蛋白特異肽的氨基酸序列為LRPVAAEIYGTK；所述同位素標(biāo)記牛乳鐵蛋白特異肽的氨基酸序列為LRPV^*AAEI^*YGTK，其中V^*和I^*為碳氮全同位素標(biāo)記的氨基酸；所述同位素標(biāo)記牛乳鐵蛋白內(nèi)標(biāo)的氨基酸序列為GRDPYKLRPV^*AAEI^*YGTKESPQTHY，其中V^*和I^*為碳氮全同位素標(biāo)記的氨基酸。

本發(fā)明試劑盒的關(guān)鍵：在堿性胰蛋白酶酶解的牛乳鐵蛋白產(chǎn)物中經(jīng)實驗確認(rèn)了牛乳鐵蛋白所獨自具有的多肽產(chǎn)物；根據(jù)該肽段的氨基酸序列設(shè)計出同位素標(biāo)記的特異肽和同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)肽的序列，并經(jīng)化學(xué)合成獲得三種高純度的多肽成品。試劑盒中的其他試劑和物品，可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)進行確定，也可根據(jù)需求在市場選擇優(yōu)化，例如參照CN102590413A中所使用的部分試劑。