[發(fā)明專利]一種獲得山羊Dlk1基因新轉(zhuǎn)錄剪切體的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310186871.2
• 申請(qǐng)日: 2013-05-20
• 公開（公告）號(hào): CN104164437A
• 公開（公告）日: 2014-11-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 仲濤;張紅平;李利;靳鵬飛;王林杰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/12
• 分類號(hào): C12N15/12;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于家畜基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種獲得山羊Dlk1基因新轉(zhuǎn)錄剪切體的方法。

背景技術(shù)

Dlk1基因（Delta-like?homolog?1）位于Dlk1-Dio3印記域內(nèi)，參與哺乳動(dòng)物的脂肪積累及葡萄糖代謝過(guò)程。Dlk1基因也被稱為脂肪前體因子1（Pref-1），其蛋白為跨膜糖蛋白，包含六個(gè)串聯(lián)重復(fù)表皮生長(zhǎng)因子樣的胞外基序，結(jié)構(gòu)類似Notch信號(hào)家族分子，但與Notch家族配體不同的是Dlk1的N端缺乏DSL（Delta：Serrate：Lin12）結(jié)構(gòu)域，因而不能激活Notch信號(hào)的受體分子。體外內(nèi)研究均表明Dlk1基因參與多個(gè)組織的分化，抑制脂肪的生成，可能作為Notch信號(hào)分子的拮抗物來(lái)參與Notch信號(hào)通路的調(diào)控。人體內(nèi)缺乏Dlk1表達(dá)會(huì)導(dǎo)致肥胖；敲除Dlk1的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)為中度肥胖，同時(shí)其體內(nèi)脂肪含量增加30%，表明Dlk1基因可以抑制脂肪細(xì)胞的分化。

目前，研究發(fā)現(xiàn)在人、小鼠、牛和豬Dlk1基因中存在多種轉(zhuǎn)錄剪切體（A，B，C，C₂，D，D₂和E型），其中A型和B型剪切體編碼具有抑制脂肪細(xì)胞分化功能的長(zhǎng)鏈可溶蛋白；其它剪接體編碼不具抑制功能的短鏈蛋白。另外，研究還發(fā)現(xiàn)Dlk1-C₂過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠也會(huì)出現(xiàn)肌肉肥大。在豬多個(gè)組織中均有Dlk1-A，Dlk1-B和Dlk1-C₂表達(dá)，其中Dlk1-C₂表達(dá)量最高，推測(cè)在豬肌肉生長(zhǎng)和脂肪沉積等方面發(fā)揮著重要的作用。目前在山羊上還未見有關(guān)Dlk1基因不同轉(zhuǎn)錄剪切體的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供山羊Dlk1基因的新轉(zhuǎn)錄剪切體、其擴(kuò)增引物及擴(kuò)增方法。

本發(fā)明所述的山羊Dlk1基因，有三種轉(zhuǎn)錄剪切體Dlk1-AS1，Dlk1-AS2和Dlk1-AS3，其核苷酸序列分別如SED?ID?NO.1，SED?ID?NO.2和SED?ID?NO.3所示。

本發(fā)明提供了用于擴(kuò)增山羊Dlk1基因的兩組擴(kuò)增引物：

正向外引物Dlk1-1F的核苷酸序列如SED?ID?NO.4所示；

反向外引物Dlk1-1R的核苷酸序列如SED?ID?NO.5所示；

正向內(nèi)引物Dlk1-2F的核苷酸序列如SED?ID?NO.6所示；

反向內(nèi)引物Dlk1-2R的核苷酸序列如SED?ID?NO.7所示。

本發(fā)明還提供了一種擴(kuò)增山羊Dlk1基因，包括三種轉(zhuǎn)錄剪切體Dlk1-AS1，Dlk1-AS2和Dlk1-AS3的方法，步驟如下：

步驟1：提取山羊肌肉組織的總RNA；

步驟2：從近緣物種人，小鼠，牛和豬Dlk1基因序列中分析保守序列，以此作為參考來(lái)設(shè)計(jì)所述引物組；

步驟3：以步驟1所得總RNA為模板，以所述的兩組引物為引物，通過(guò)巢式PCR擴(kuò)增獲得山羊Dlk1基因的片段。

對(duì)所得序列用NCBI網(wǎng)站進(jìn)行blastn在線分析，與Dlk1序列一致性最高的序列都是Dlk1在哺乳動(dòng)物中的同源序列，可以確定所得序列為山羊Dlk1基因。

利用Clustalx?V2.0軟件對(duì)山羊Dlk1基因（包括三種轉(zhuǎn)錄剪切體Dlk1-AS1，Dlk1-AS2和Dlk1-AS3）的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)分析并使用MEGA5.2軟件構(gòu)建NJ樹。

本發(fā)明以山羊肌肉組織為材料，利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）、巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（nested-PCR），對(duì)山羊Dlk1基因進(jìn)行了研究，首次從山羊肌肉組織中克隆得到了Dlk1基因三種轉(zhuǎn)錄剪切體（Dlk1-AS1，Dlk1-AS2和Dlk1-AS3），并對(duì)其同源性和進(jìn)化地位進(jìn)行了分析，對(duì)研究山羊Dlk1基因不同轉(zhuǎn)錄剪切體在脂類代謝過(guò)程發(fā)揮的生物學(xué)功能具有重要意義。