[發明專利]新型陽離子接枝共聚物及多重復合非病毒基因載體制備方法和應用

有效

• 申請號: 201310186799.3
• 申請日: 2013-05-20
• 公開（公告）號: CN103665384A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 李娟;尹少平;王晶;楊勇
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: C08G81/00
• 分類號: C08G81/00;C08G73/04;C08G63/91;C08G63/08;C12N15/63;A61K47/34;A61K48/00;A61P35/00
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技術領域

本發明屬于生物技術和藥物制劑領域，涉及新型陽離子接枝共聚物及多重復合非病毒基因載體制備方法。具體涉及新型陽離子接枝共聚物PCL-g-LPEI的合成；本發明還涉及構建PCL-g-LPEI/DNA復合物和載透明質酸(HA)多重基因復合物的制備方法，作為低毒高效基因載體在基因治療中應用。?

背景技術

近年來，新型基因治療方法為癌癥治療、遺傳疾病等提供良好的發展前景。研制安全有效、細胞毒性低和腫瘤靶向性非病毒基因傳遞系統，將成為基因治療成功的重要因素。基因載體是目前基因治療的關鍵難點，主要包括病毒載體和非病毒載體。盡管病毒載體轉染效率較高，但存在免疫原性、致瘤性、細胞毒性，制備復雜，對外源基因容量有限(Collin?SA，Guinn?BA，Harrison?PT，et?al.Viral?vectors?in?cancer?immunotherapy：which?vector?for?which?strategy.Current?Gene?Therapy.2008，8：66-78.)等自身難以克服的隱患，臨床應用受到限制。非病毒基因載體轉染效率較病毒載體低，但易于制備生產，無免疫原性，無傳染性，載基因容量大，具有良好生物相容性(Schatzlein?AG.Non-viral?vectors?in?cancer?gene?therapy：principles?and?progress.Anti-Cancer?Drugs.2001，12：275-304.)，已成為基因治療領域的研究熱點。?

聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)是迄今為止研究得最為廣泛的陽離子聚合物非病毒基因載體。PEI易于逃離內涵體，在體內外均有較高的轉染效率，但細胞毒性大，不能應用于臨床。有研究報道PEI的轉染效率隨分子量的增加而提高(Kunath?K，Harpe?A，Fischer?D，et?al.Low-molecular-weight?polyethylenimine?as?a?non-viral?vectors?for?DNA?delivery：comparison?of?physicochemical?properties，transfection?efficiency?and?in?vivo?distribution?with?high-molecular-weight?polyethylenimine.Journal?of?Controlled?Release.2003，89：113-125.)，細胞毒性也隨之增大。PEI的細胞毒性，主要是由其正電性對細胞膜具有較好的親和力所致，也是其攜載基因進入細胞的作用原理。如何改造陽離子聚合物PEI，降低細胞毒性、提高轉染效率成為基因載體研究亟待解決的問題。?

治療基因成功進入靶細胞進行表達，需要克服一系列生理障礙：血液循環穩定性，細胞膜，內涵體，胞漿傳遞以及細胞核膜。帶大量正電荷PEI與基因形成帶正電的復合體，內吞進入細胞形成內含體，通過質子海綿效應成功從內含體逃逸，進入細胞質。蘇靖采用酰胺鍵交聯小分子量PEI衍生物作為基因載體，細胞毒性降低，轉染效率提高，在多種細胞中具有?較好的生物活性，但形成的PEI-基因復合物多帶有正電荷，易與血液中帶負電分子如血清蛋白等凝聚，甚至引起補體活化和血細胞凝固(中國專利，申請號：201110327084.6.)。PEG通過共價鍵或離子鍵修飾PEI，可提高生物相容性，遮蔽表面正電荷，降低與血清蛋白等物質的結合，延長體內循環時間(中國專利，申請號：200880023048.7.)，但形成基因復合物穩定性差，粒徑過大，不易被細胞攝取。采用疏水性材料修飾PEI，可改善基因復合物的穩定性，降低粒子平均粒徑。將超支化PEI與疏水性聚(γ-苯甲基L-谷氨酸鹽)片段(PBLG)反應生成水溶性PP，可有效包載pDNA，避免核酸酶的降解，形成平均粒徑為96nm的納米粒，細胞毒性降低，且在HeLa細胞、Vero細胞和293T細胞的體外轉染效率明顯高于PEI(Tiana?H，Xiong?W，Wei?J，et?al.Gene?transfection?of?hyperbranched?PEI?grafted?by?hydrophobic?amino?acid?segment?PBLG.Biomaterials.2007，28：2899-2907.)。?