[發明專利]鄰苯二甲酸二丁酯檢測試劑盒及其制備和使用方法

有效

• 申請號: 201310185247.0
• 申請日: 2013-05-17
• 公開（公告）號: CN103257232A
• 公開（公告）日: 2013-08-21
• 發明（設計）人: 劉付建;郭新東;盧宇靖;黃金鳳;梁德沛;陳紀文;鐘國鳴
• 申請（專利權）人: 廣東產品質量監督檢驗研究院;廣州市質量監督檢測研究院;廣東工業大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 萬志香;秦雪梅

技術領域

本發明涉及一種添加劑檢測技術，具體來說，特別是涉及一種用于鄰苯二甲酸二丁酯含量檢測的酶聯免疫試劑盒及其制備和使用方法。

背景技術

鄰苯二甲酸二丁酯（Dibutyl?phthalate，DBP）是一種優良的增塑劑，由于其相對價廉且加工性好，在國內外使用非常廣泛。鄰苯二甲酸二丁酯對于多種樹脂具有很好的溶解能力，具有色澤淺、電性能好、揮發性低、氣味小和耐低溫等特點。鄰苯二甲酸二丁酯是硝化纖維、醋酸纖維、聚氯乙烯等的理想增塑劑，具有良好的軟化作用和優良的穩定性、粘著性、耐撓曲性和防水性。此外，鄰苯二甲酸二丁酯也用于制造油漆、膠粘劑、人造纖維、印刷油墨、安全玻璃、染料、殺蟲劑、香料的溶劑和織物潤滑劑等化工產品。

但是，鄰苯二甲酸二丁酯能引起中樞神經和周圍神經系統的功能性變化，然后進一步引起它們組織上的改變；有趨肝性，可引起輕度致敏作用，具有中等程度的蓄積作用和輕度刺激作用，是一種可疑的內分泌干擾素。目前美國、歐盟等多國都明確禁止或限制使用鄰苯二甲酸二丁酯，我國也鼓勵使用其他化學品替換有毒有害的鄰苯二甲酸二丁酯添加在日化用品中。因此，快速檢測鄰苯二甲酸二丁酯在涂料中的含量是非常必要的。

發明內容

基于此，本發明提供一種鄰苯二甲酸二丁酯檢測試劑盒和一種鄰苯二甲酸二丁酯檢測試劑盒的制備和使用方法，該試劑盒在檢測鄰苯二甲酸二丁酯時可一次連續檢測多個樣品，具有便捷，快速，靈敏、成本低的特點。

本發明的第一個目的在于提供一種鄰苯二甲酸二丁酯檢測試劑盒，主要包括：

1）包被鄰苯二甲酸二丁酯特異性抗原的酶標板：所述酶標板的每個微孔內鄰苯二甲酸二丁酯特異性抗原的濃度為1-5μg/mL；

2）鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體工作液：該鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體工作液的濃度為1-5μg/mL；

所述鄰苯二甲酸二丁酯特異性抗原與鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體的用量為2.5:1。

在其中一個實施例中，所述鄰苯二甲酸二丁酯檢測試劑盒還包括有酶標二抗，所述酶標二抗是濃度按1:10000稀釋的辣根過氧化物酶標記羊抗鼠二抗。

在其中一個實施例中，，所述鄰苯二甲酸二丁酯特異性抗原的濃度為2.5μg/mL；所述鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體的濃度為2μg/mL。

在其中一個實施例中，所述鄰苯二甲酸二丁酯檢測試劑盒還包括鄰苯二甲酸二丁酯標準品溶液、底物顯色劑、洗滌液、終止液、封閉液和濃縮樣品稀釋液。

在其中一個實施例中，所述鄰苯二甲酸二丁酯標準品溶液濃度分別為0，0.5μg/L，1.0μg/L，2.0μg/L，10.0μg/L，20.0μg/L，50.0μg/L；所述底物顯色劑由顯色劑A和顯色劑B組成，所述顯色劑A為過氧化氫或過氧化脲，所述顯色劑B為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺；所述終止液為1-2mol/L的硫酸溶液；所述洗滌液為含有0.05%-0.5%吐溫-20的0.01M，pH7.4的磷酸鹽緩沖液；所述濃縮樣品稀釋液為0.01M，pH7.4的磷酸鹽緩沖液；所述封閉液為含5%脫脂奶粉的0.01M，pH7.4的磷酸鹽緩沖液。

本發明的第二個目的在于提供一種上述鄰苯二甲酸二丁酯檢測試劑盒的制備方法，主要包括以下步驟：

1）制備鄰苯二甲酸二丁酯特異性抗原

將鄰苯二甲酸與2-乙基己醇混合于環己烷中，加入濃硫酸作為催化劑，回流反應，制得2-（2-乙基己酯）苯甲酸；將上述2-（2-乙基己酯）苯甲酸與2-乙基-6叔丁氧酰胺丙醇混合于環己烷中，加入濃硫酸，回流反應，制得鄰苯二甲酸二丁酯被叔丁氧酰胺基胺化產物；隨后將上述中間產物加入三氟乙酸中，回流反應，脫去叔丁氧酰基的保護，裸露出胺基，制得能夠與蛋白質偶聯的氨基鄰苯二甲酸二丁酯的半抗原；在N-羥基丁二酰胺和碳二亞胺的催化下，再與載體蛋白偶聯，制得鄰苯二甲酸二丁酯特異性抗原；所述的載體蛋白為牛血清白蛋白、卵清蛋白、兔血清白蛋白或甲狀腺球蛋白；

2）包被酶標板

將上述鄰苯二甲酸二丁酯特異性抗原包被于酶標板中，所述酶標板的每個微孔內鄰苯二甲酸二丁酯特異性抗原的濃度為1-5μg/mL；

3）動物免疫

以步驟1）中合成的鄰苯二甲酸二丁酯特異性抗原為免疫原免疫小鼠，取免疫小鼠的血清，檢測該血清抗鄰苯二甲酸二丁酯的效價和抑制價，選取效價和抑制價最高的免疫小鼠；

4）細胞融合與篩選