[發明專利]尼羅羅非魚NPB29肽及其編碼核酸和應用

有效

• 申請號: 201310185239.6
• 申請日: 2013-05-17
• 公開（公告）號: CN103275204A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 李文笙;楊露;李波
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C07K14/46
• 分類號: C07K14/46;C12N15/12;C12N15/10;A23K1/18;A23K1/16
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 譚英強

技術領域

本發明涉及一種尼羅羅非魚的新蛋白及其編碼核酸，同時，本發明還涉及該新蛋白的29肽的功能應用。

背景技術

羅非魚為一種中小形魚。現在它是世界水產業的重點科研培養的淡水養殖魚類，且被譽為未來動物性蛋白質的主要來源之一。原產于非洲，和鱸魚相似。通常生活于淡水中，也能生活于不同鹽份含量的咸水中，可以存活于在湖，河，池塘的淺水中。它有很強的適應能力，且對溶氧較少之水有極強之適應性。絕大部分羅非魚是雜食性，常吃水中植物和碎物。羅非魚作為鱈魚的替代品，國際市場的需求量不斷增加。在全球淡水魚貿易中，羅非魚占第3位，僅次于鮭魚和鱒魚，具有極高的經濟價值。隨著養殖和出口規模的不斷擴大，對餌料配置的要求也不斷提高，由于飼料成本不斷增加，研究趨向于以植物蛋白代替魚粉來減少成本。但是魚類攝入植物蛋白飼料，會出現攝食量減少、體重減輕的現象，這種結果與初衷相悖。因此采用分子生物學手段，深入研究吉富羅非魚攝食和生長發育的調控機制，對于科學飼養管理和提高養殖產量，改善魚肉質量以獲取更大的市場占有率從而取得更大的經濟價值有著重要的意義。

神經肽B(neuropeptide?B,NPB)首先從牛的下丘腦中分離，純化得到。在哺乳動物中，NPB主要以29肽形式存在，廣泛分布于中樞神經系統，參與攝食調控，能量代謝平衡，內分泌調節及痛覺感受等多種生理功能，但NPB在硬骨魚中的功能研究尚為空白。

發明內容

本發明的一個目的在于提供一種尼羅羅非魚神經肽NPB蛋白及編碼核酸。

本發明的另一個目的是提供上述尼羅羅非魚NPB29肽功能肽在制備調節羅非魚攝食添加劑中的應用。

本發明所采取的技術方案是：

本發明提供一種新型的尼羅羅非魚NPB。

NPB29肽WYKQVAGPTYYSVGRASGLLSGIRRSAYV（SEQ?ID?NO：1），以不同濃度（0.3μg，0.6μg和1.2μg）腹腔注射尼羅羅非魚經腹腔注射后，可以刺激羅非魚腦中攝食因子NPY，CCK1，的表達，對垂體中的GH有抑制反應，對PRL有刺激反應。CCK1和PRL是抑制攝食因子，GH是生長激素。注射NPB29肽促進CCK1，PRL并抑制GH的mRNA表達水平，說明NPB作為一種飽食因子同時還參與PRL的表達。本發明的NPB29肽有望開發為新的羅非魚生長調節劑。

本發明采取RT-PCR和RACE技術進行克隆。首先利用Invitrogen公司產品Trizol?Reagent進行全腦總RNA的提取，再利用Toyobo公司產品Rever?Tra?Ace-a-Tm?First?Strand?cDNA?Synthesis?Kit進行RT-PCR。利用NCBI的EST檢索功能，找到了羅非魚中公布出的部分預測序列，從而設計特異引物，進行NPB?cDNA部分片段的克隆，然后根據得到的中間片段，設計設計5’-RACE和3’RACE的特異性引物，從而進行最后用設計好的簡并引物進行5’-RACE和3’RACE。。最后在3’和5’非編碼區設計特異引物，進行開放讀碼框ORF的克隆，確定序列。

附圖說明

圖1是NPB中間片段克隆電泳結果，NC為陰性對照，M為Marker，1,2,3分別為不同的組織模板，在1對應的模板中出現預期片段；

圖2是NPB3’RACE克隆電泳結果，其中1為所取的腦組織，M為marker；

圖3是NPB5’RACE克隆電泳結果，其中M為Marker，1為所選取的腦組織；

圖4是NPB?ORF克隆電泳結果，其中M為Marker，1為所選取的腦組織；

圖5是GH和NPY?cDNA的部分片段克隆電泳結果，其中1為所選取的垂體組織，2為所選取的下丘腦，M為Marker；

圖6是PRL?cDNA的部分片段克隆電泳結果，其中M為Marker，1為所選取的垂體組織；

圖7是CCK1cDNA的部分片段克隆電泳結果，其中M為Marker，1為所選取的腦組織；

圖8是NPY溶解曲線結果及其對應的標準曲線；

圖9是CCK1溶解曲線結果及其對應的標準曲線；

圖10是GH溶解曲線結果及其對應的標準曲線；

圖11是PRL溶解曲線結果及其對應的標準曲線；

圖12是腹腔注射NPB29肽后對NPY?mRNA水平的影響；

圖13是腹腔注射NPB29肽后對CCK1mRNA水平的影響；

圖14是腹腔注射NPB29肽后對GH?mRNA水平的影響；