[發(fā)明專利]一種尿液中肌氨酸的衍生化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310185124.7
• 申請日: 2013-05-20
• 公開（公告）號: CN103278585A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 宋國新;肖晉芬;高嶧涵;許雪姣;趙建豐;胡耀銘
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 張磊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及一種尿液中肌氨酸的衍生化方法。

背景技術(shù)

肌氨酸即N-甲基甘氨酸，又名2-甲氨基乙酸，化學(xué)式為CH₃NHCH₂COOH。肌氨酸有甜味，溶于水。它是膽堿自然代謝為甘氨酸過程中的一個中間體。肌氨酸是蛋白質(zhì)的重要組成部分，在活細胞代謝過程中起到非常重要的作用。肌氨酸在人體內(nèi)的基本功能為：（1）增加肌肉細胞的含水量，當(dāng)所有的肌肉細胞都吸收較多量的水分而增加容積時，肌肉會變得更加飽滿、有形；（2）肌氨酸可幫助肌肉細胞儲存能量，人體的肌纖維中含有未鍵結(jié)的肌氨酸和帶有磷酸根的磷酸肌氨酸，其中磷酸肌氨酸約占了三分之二總肌氨酸的含量。當(dāng)肌肉收縮產(chǎn)生運動時，身體會利用三磷酸腺苷(ATP)當(dāng)作其能量來源，但由于人體的肌肉細胞只可提供低于十秒急速收縮所需的ATP能量，必須要有更多的ATP產(chǎn)生才能維持持續(xù)的運動，此時存于肌肉中的磷酸肌氨酸會提供磷酸根而使得ATP再次生合成。因此，當(dāng)肌肉內(nèi)的肌氨酸較多時，肌肉便有更大的潛在力量得以發(fā)揮。

Sreekumar等研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)移性前列腺癌樣本中，有79％樣本肌氨酸的水平是顯著增高，在局限性前列腺癌樣本中有42％的樣本肌氨酸水平增加。但在良性前列腺組織中，未測到肌氨酸。這表明在監(jiān)測前列腺癌進展和侵襲過程中，肌氨酸具有作為前列腺癌標志的潛能。

因此，因此對尿液中的肌氨酸進行檢測可提高前列腺癌診斷的敏感性及特異性，有非常重要的意義。

傳統(tǒng)的分析肌氨酸的方法主要有氨基酸分析儀、電位滴定分析、高效液相色譜和液/質(zhì)聯(lián)用法，這些方法受價格昂貴、靈敏度、選擇性等的限制，無法實現(xiàn)普遍應(yīng)用。氣相色譜-低分辨率質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-LRMS）因其通用性、可靠性和高性價比，廣泛裝備于各類醫(yī)療檢測室和科研實驗室，是最容易實現(xiàn)廣泛應(yīng)用的儀器。在常用的GC/MS分析肌氨酸方法中，多采用硅烷化衍生化方法，此衍生化方法干擾多，專一性差，且衍生化產(chǎn)物不穩(wěn)定。因此開發(fā)一種基于GC/MS方法的新型衍生化方法以測定尿樣代謝物中肌氨酸成為現(xiàn)實的需要，對于前列腺癌患者的早期診斷和治療有著重大的現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提供一種尿液中肌氨酸的衍生化方法。

本發(fā)明提出的一種尿液中肌氨酸的衍生化方法，具體步驟如下：?

（1）將尿液離心，取上清液，用酸調(diào)節(jié)上清液的pH值為4-5；

（2）將步驟（1）所得的上清液加入陽離子交換柱中，用去離子水充分清洗；

（3）用氨水洗脫步驟（2）中的陽離子交換柱，用安瓿瓶收集洗脫液2-3mL；

（4）步驟（3）所得的洗脫液在45-55℃下用氮氣吹干；

（5）在步驟（4）所得的產(chǎn)物中加入50-200?μL甲苯、1-5?mg多聚甲醛固體顆粒和10-30?μL丙烯酸丁酯衍生化試劑，將安瓿瓶封口后混合均勻，隨后置于80-150℃下烘箱中反應(yīng)15-30?min；

（6）步驟（5）所得產(chǎn)物冷卻至室溫后，加入含叔丁基茴香醚內(nèi)標的甲醇溶液，混合均勻，取1?μL進行氣相色譜-質(zhì)譜檢測。

本發(fā)明中，步驟（1）中使用的酸為HCl，濃度是2?mol/L。

本發(fā)明中，步驟（5）中烘箱的溫度為110-120℃，反應(yīng)時間為?20?min。

本發(fā)明中，步驟（6）中含叔丁基茴香醚內(nèi)標的甲醇溶液的濃度是0.1μg/μL。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的衍生化反應(yīng)。該反應(yīng)是利用肌氨酸與多聚甲醛在甲苯試劑作用下生成1,3-偶極體，1,3-偶極體與丙烯酸丁酯環(huán)加成為五元雜環(huán)化合物。此衍生反應(yīng)生成的雜環(huán)化合物揮發(fā)性好，穩(wěn)定性強，且由于衍生物是環(huán)狀化合物，質(zhì)譜圖中的分子離子峰強，易于辨認。

本發(fā)明中，肌氨酸的1,3-偶極加成衍生化的反應(yīng)機制為：

在本發(fā)明中，提出了一種新的衍生化方法用于尿液中肌氨酸的定性定量檢測，該發(fā)明具有很好的創(chuàng)新性，克服了傳統(tǒng)硅烷化衍生方法的缺點。反應(yīng)過程快速、簡單、條件容易控制，反應(yīng)產(chǎn)物單一，穩(wěn)定性強。同時本發(fā)明采用了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的分析檢測技術(shù)，具有毛細管色譜的高分離和質(zhì)譜的精確鑒定等特點，能夠準確地對肌氨酸進行定性定量分析，彌補了目前使用的其他檢測方法所面臨的如儀器昂貴和分析成本較高等缺點，特別適合尿液中肌氨酸的快速定性定量分析。