[發明專利]表達融合外源表位N蛋白的重組小反芻獸疫病毒的構建及應用

有效

• 申請號: 201310182866.4
• 申請日: 2013-05-17
• 公開（公告）號: CN103224914A
• 公開（公告）日: 2013-07-31
• 發明（設計）人: 步志高;陳偉業
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;A61K39/155;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 北京市漢信律師事務所 11373
• 代理人: 王文生

技術領域

本發明涉及免疫標記疫苗領域。具體地，本發明涉及表達融合外源表位N蛋白的重組小反芻獸疫病毒的構建及應用。

背景技術

小反芻獸疫(Peste?des?petits?ruminants，PPR)是由副黏病毒科麻疹病毒屬的小反芻獸疫病毒(peste?des?petits?ruminants?virus，PPRV)引起的急性、烈性傳染病；臨床以發熱、口炎、腹瀉和肺炎為特征。對山羊和綿羊等小反芻動物危害嚴重，給畜牧業造成重大經濟損失[1]。PPR于2007年傳入我國西部邊境地區，導致局部疫情，對我國畜牧養殖業形成嚴重威脅。小反芻獸疫病毒基因組為不分節段的單股負鏈RNA，基因組長15948bp。從3’至5’依次分布著N、P、M、F、H、L基因，分別編碼核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)、基質蛋白(M)、融合基質蛋白(F)、血凝素蛋白(H)和大聚合蛋白(L)這六種結構蛋白，P基因還編碼兩種非結構蛋白C和V。N蛋白為小反芻獸疫病毒的核衣殼蛋白，是PPRV中含量最豐富和免疫原性最強的結構蛋白，在病毒的復制和轉錄中起主要的作用，其抗原性穩定，在病毒感染的動物血清中針對N蛋白的抗體占主導地位，主要用于檢測診斷研究[2-4]，是引入外源表位用以構建標記疫苗的合適靶蛋白。

防治小反芻獸疫的主要措施就是進行疫苗免疫接種。常用的PPRV疫苗株Nigeria?75/1是在Vero細胞上多次傳代致弱所獲得，是一種安全經濟的疫苗，但該疫苗的缺陷在于無法區分自然感染動物與免疫接種動物[5]。我國西部小反芻獸疫疫情的防控需要有效的血清學監控，因此標記疫苗的研制有其必要性和緊迫性。本研究室小反芻獸疫病毒反向遺傳操作平臺的建立為小反芻獸疫標記疫苗的構建提供全新的技術途徑[6]，在此基礎之上本研究于PPRV?N蛋白羧基端分別引入HA、FLAG、5B19表位，利用反向遺傳操作技術，分別成功拯救出表達融合外源表位N蛋白的重組病毒，并對重組病毒的生物學特性進行了研究。

發明內容

核衣殼蛋白(nucleocapsid，N)是小反芻獸疫病毒(peste?des?petits?ruminants?virus，PPRV)中含量最豐富和免疫原性最強的結構蛋白，是引入外源表位用以構建標記疫苗的合適靶蛋白。為構建小反芻獸疫標記疫苗，首先分別構建了在N蛋白羧基端引入外源表位(HA：YPYDVPDYA；FLAG：DYKDDDDK；小鼠肝炎病毒S2糖蛋白的優勢B細胞表位5B19：SPLLGCIGSTCAEDGN)的融合基因N^HA、N^FLAG、N^5B19，并克隆至pCAGGS載體，以其替代PPRV反向遺傳拯救系統中的表達天然PPRV?N蛋白的輔助質粒后仍能夠成功拯救出小反芻獸疫病毒，且拯救效率前后相差無幾，表明融合外源表位后對N蛋白的功能影響不大。隨后分別以N^HA、N^FLAG、N^5B19基因替換PPRV感染性克隆中的N基因，體外救獲表達融合外源表位N蛋白的重組病毒。蛋白印跡試驗和間接免疫熒光試驗表明分別融合外源表位的N蛋白獲得了正確表達；體外生長動力學試驗分析表明重組病毒的生長最高滴度雖比親本毒低，但并不影響其今后作為標記疫苗的使用。小鼠免疫試驗表明，本研究構建的三種標記疫苗rPPRV/GFP/N^HA、rPPRV/GFP/N^FLAG、rPPRV/GFP/N^5B19都能夠誘導特異性的針對外源表位的抗體，具有顯著的標記作用，同時誘導的PPRV病毒中和抗體能夠100％轉陽。這些結果初步表明標記疫苗在山羊、綿羊等小反芻動物上使用的使用價值，不但能夠提供區別自然感染和疫苗免疫感染的外源標記基因的抗體，還能夠提供顯著的PPRV病毒中和抗體以預防小反芻獸疫，是預防小反芻獸疫的新一代的標記弱毒疫苗。

更具體地，本發明提供以下各項：