[發明專利]一種檢測尿液中PCA3基因和PSA基因表達量的熒光定量PCR法及其診斷試劑盒

在審

• 申請號: 201310182694.0
• 申請日: 2013-05-17
• 公開（公告）號: CN104164474A
• 公開（公告）日: 2014-11-26
• 發明（設計）人: 劉代新;何勝祥
• 申請（專利權）人: 劉代新
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用于檢測尿液樣本中PCA3基因和PSA基因表達量的熒光定量PCR法，其特征在于：

為避免PCA3和PSA基因組DNA的干擾，首先跨內含子設計PCA3和PSA的特異性的引物和Taqman熒光探針，2個探針使用不同的熒光染料進行標記，可以在同一反應液中進行擴增和檢測，同時加入內參檢測引物和探針對樣本處理和PCR擴增進行全程監控。然后利用含PCA3和PSA特異性擴增片段的體外轉錄RNA定量標準品制作標準曲線，對尿液樣本中PCA3和PSA?mRNA分別進行定量。最后通過對比PCA3基因和PSA基因表達量，建立PCA3評分標準，PCA3分數可以協助臨床醫生判斷患者得前列腺癌的可能性，有效預測前列腺穿刺陽性活檢率。

2.如權利1所述，PCA3?mRNA檢測所用的引物和探針為：

上游引物PCA3-F序列為5′-GCTTCCTGTGTGTGTGGATATTTAA-3′；

下游引物PCA3-R序列為5′-GAGAAGCTGGCATCAGAAAAACA-3′；

熒光探針PCA3-P序列為5′-TCCTGGTCTCCCTCGGCTGCA-3′，5′端標記FAM熒光報告基團，3′端標記BHQ1熒光淬滅基團。

3.如權利1所述，PSA?mRNA檢測所用的引物和探針為：

上游引物PSA-F序列為：5′-GTCTGCGGCGGTGTTCTG-3′；

下游引物PSA-R序列為：5′-GCTGTGGCTGACCTGAAATACC-3′；

熒光探針PSA-P序列為：5′-CCCCAGTGGGTSCTCACAGCTGC-3′，5′端標記HEX熒光報告基團，3′端標記BHQ1熒光淬滅基團。

4.如權利1所述，內參基因檢測所用的引物和探針為：

上游引物IC-F序列為：5′-TGAAGGCTCATGGCAAGAAAGT-3′；

下游引物IC-R序列為：5′-TTGTCACAGTGCAGCTCACTCA-3′；

熒光探針ICP序列為：5′-ACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCAC-3′，5′端標記ROX熒光報告基團，3′端標記BHQ2熒光淬滅基團。

5.如權利1所述，PCA3標準品中含的特異性擴增片段為：

GAGAAGCTGGCATCAGAAAAACAGAGGGGAGATTTGTGTGGCTGCAGCCGAGGGAGACCAGGAAGATCTGCATGGTGGGAAGGACCTGATGATACAGAGGTGAGAAATAAGAAAGGCTGCTGACTTTACCATCTGAGGCCACACATCTGCTGAAATGGAGATAATTAACATCACTAGAAACAGCAAGATGACAATATAATGTCTAAGTAGTGACATGTTTTTGCACATTTCCAGCCCCTTTAAATATCCACACACACAGGAATC。

6.如權利1所述，PSA標準品中含的特異性擴增片段為：

GGGCAGTCTGCGGCGGTGTTCTGGTGCACCCCCAGTGGGTCCTCACAGCTGCCCACTGCATCAGGAACAAAAGCGTGATCTTGCTGGGTCGGCACAGCCTGTTTCATCCTGAAGACACAGGCCAGGTATTTCAGGTCAGCCACAGCTTCC。

7.一種PCA3和PSA?mRNA核酸熒光定量PCR檢測試劑盒，該試劑盒包括：PCA3/PSA-PCR反應液、PCA3/PSA?RNA陽性對照、陰性對照、4種已知濃度的PCA3/PSA?RNA定量標準品。

8.如權利7所述，PCA3/PSA-PCR反應液各成分的終濃度為：1X的反轉錄PCR緩沖液、4mM的MgCl₂、0.4mM的dNTP、2U的Taq?DNA聚合酶、2U的AMV逆轉錄酶、200nM的PCA3-F、200nM的PCA3-R、150nM的PCA3-P、200nM的PSA-F、200nM的PSA-R、200nM的PSA-P、100nM的IC-F、100nM的IC-R和100nM的IC-P。