[發明專利]一種嵌段聚合物固定化酶的制備方法

無效

• 申請號: 201310182635.3
• 申請日: 2013-05-17
• 公開（公告）號: CN103255125A
• 公開（公告）日: 2013-08-21
• 發明（設計）人: 徐冉;李風亭;遲成龍
• 申請（專利權）人: 同濟大學
• 主分類號: C12N11/08
• 分類號: C12N11/08;D04H1/4326;D04H1/728;D06M15/61;D06M13/123;D06M16/00;D06M101/26
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 張磊

技術領域

本發明涉及一種嵌段聚合物固定化酶的制備方法。

背景技術

游離酶的催化活性易受到pH、溫度、有機溶劑、重金屬離子等因素的影響。而酶的固定化技術能有效提高酶在極端條件下的穩定性和催化活性，同時易于回收再利用。固定化酶的材料和方法有很多種，其中納米材料固定化酶因其高載酶量受到了研究者的青睞，尤其是一些具有多孔結構、大比表面積的載體材料有利于提高固定化酶的載酶量，并有利于底物向酶活性中心和產物向反應區域以外擴散以提高固定化酶的生物活性和催化效率。

傳統粉狀或顆粒狀納米材料存在分離和回收的難題，同時排放到環境中會造成污染，而具有空間連續性的納米纖維膜作為固定化酶的載體具有較大的比表面積和高孔隙率，并且可以通過紡絲條件進行調控等優點，越來越引起人們的重視。近年來，利用電紡納米纖維固定化酶成為一個新興研究熱點。CN200610052953.8通過靜電紡絲和堿處理的方法，可以得到一種在水溶液中具有穩定形態結構的殼聚糖納米纖維膜。CN200410019230.9將殼聚糖與聚乙烯醇的混合溶液靜電紡絲制備超細纖維復合膜。Huang?等人利用膠原蛋白等生物大分子對聚（丙烯腈-丙烯酸）納米纖維膜進行表面改性，并用于脂肪酶的固定化(Huang?XJ,?Yu?AG,?Jiang?J,?Pan?C,?Qian?JW,?Xu?ZK,?J.?Mol.?Catal.?B:Enzym.?2009,?57:250-256)。然而上述納米纖維膜載體及其固定化酶存在制備工藝比較繁瑣、機械強度不夠、很難大規模生產和應用等缺點。

所以有必要研制一種制備工藝簡單、具有一定機械強度、有工業化生產潛力的納米纖維膜固定化酶，同時提高固定化酶的載酶量、催化穩定性和重復使用性。

發明內容

?針對一些固定化酶載體的載酶量和催化效率低、固定化酶過程繁瑣和載體材料難以回收等問題，本發明的目的在于提供一種具有高比表面積、高空隙率、具有一定機械強度和制備工藝簡單的嵌段聚合物固定化酶的制備方法。

本發明提出的嵌段聚合物固定化酶的制備方法，具體步驟如下：

?(1)制備聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯納米纖維膜

將聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯嵌段聚合物溶于N,N-二甲基甲酰胺和四氫呋喃組成的溶液中，配成重量百分比為5%~15%的溶液，充分溶解后，注入到靜電紡絲裝置中，在電壓為15~25千伏，噴絲頭溶液流量為0.5~1.5毫升/小時、接收距離為10~20厘米的條件下進行電紡絲，獲得纖維直徑為100~500nm的甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯納米纖維膜，將納米纖維膜在真空干燥箱中在30℃~50℃的條件下干燥5小時~10小時，即得聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯納米纖維膜；其中：N,N-二甲基甲酰胺和四氫呋喃的質量比為1:1~1:4；

(2)將步驟(1)所得的聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯納米纖維膜浸入?1%~10%的聚乙二胺水溶液中，密封后于70℃的恒溫條件下震蕩1~3小時，震蕩速度為30~120轉/分鐘；取出處理后的聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯納米纖維膜并用pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液充分沖洗，以除去膜上殘余的聚乙二胺；將胺化之后的聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯納米纖維膜浸入1%~5%的戊二醛水溶液中，密封后于25℃恒溫條件下震蕩1~2小時，震蕩速度為30~120轉/分鐘；

(3)將步驟(2)所得聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯納米纖維膜用pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液充分沖洗，以除去膜上殘余戊二醛；將經過戊二醛活化的納米纖維復合膜浸沒于濃度為0.1~2毫克/毫升的酶磷酸鹽緩沖溶液中，密封后于4℃的恒溫條件下震蕩1~5小時，震蕩速度為30~120轉/分鐘；從溶液中取出納米纖維膜，用去離子水反復沖洗3~5次，即可得到聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯納米纖維膜固定化酶；將固定化酶的納米纖維膜浸入pH為7.0的磷酸緩沖溶液中，于4℃下儲存備用。

本發明中，所述聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯的重均分子量為8~12萬，數均分子量為2~5萬。

本發明中，步驟(3)中所述酶磷酸鹽緩沖溶液中所用的酶為：漆酶、過氧化物酶、蛋白酶、淀粉酶或脂肪酶中的一種。

本發明的有益效果在于：

（1）聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯納米纖維膜的制備及其酶固定化工藝簡單。

（2）聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯納米纖維膜具有高比表面積和高空隙率，有利于提高固定化酶的載酶量和提高固定化酶的催化效率。