[發(fā)明專利]玉米耐逆基因ZmPsaH及其編碼蛋白和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310180581.7
• 申請(qǐng)日: 2013-05-10
• 公開（公告）號(hào): CN103266115A
• 公開（公告）日: 2013-08-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃全生;郝曉燕;劉小利;陳勛基;陳果;足木熱木·吐爾遜;李建平;邵琳;危曉薇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/29
• 分類號(hào): C12N15/29;C12N15/82;C07K14/415;A01H5/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，公開了一種玉米參與光合作用的相關(guān)蛋白ZmPsaH及其編碼基因和應(yīng)用。

背景技術(shù)

鹽堿、干旱、極端溫度等非生物脅迫是嚴(yán)重影響植物生長和發(fā)育造成農(nóng)作物減產(chǎn)的主要因素。這些脅迫會(huì)引發(fā)植物的光合作用效率下降，從而使植物的生長發(fā)育受到抑制。越來越多的研究表明逆境脅迫下植物葉片光合參數(shù)、滲透勢、水勢、蒸騰速率、葉溫以及相對(duì)含水量發(fā)生變化(Sudhir?&?Murthy，2004)，同時(shí)也影響光合作用器官的組分，如酶、光合色素、類囊體膜蛋白及膜脂，這些參數(shù)的變化取決于逆境脅迫程度和持續(xù)時(shí)間(Lakshmi?et?al.，1996；Misra?et?al.，1997)以及不同的植物品種(Megdiche?et?al.，2008)。逆境脅迫導(dǎo)致光合作用效率下降的主要原因有以下幾個(gè)因素：①氣孔關(guān)閉，導(dǎo)致胞間CO2濃度下降；②非氣孔限制(Mehta?et?al.，2010)，如光合膜蛋白的減少(Munns?&?Tester，2008)；③光合色素含量的減少(Shu?et?al.，2012)。逆境脅迫下植物光合作用的種種變化似乎與其脅迫程度、所采用的材料和測定時(shí)間有關(guān)，尚缺乏統(tǒng)一的令人滿意的解釋，但是鹽脅迫下植物光合作用的影響將會(huì)得到越來越多人的認(rèn)識(shí)。

通過鹽生植物或轉(zhuǎn)基因手段，研究鹽脅迫下植物光合作用的響應(yīng)及其保護(hù)機(jī)制將會(huì)成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。

光合作用是地球最重要的生命活動(dòng)過程之一。它是由存在于植物葉綠體類囊體膜上的6種蛋白質(zhì)復(fù)合體協(xié)同完成(Jansson?S等1996；Sumpson?D?J等1989)，其中光系統(tǒng)I(PSI)作為復(fù)臺(tái)體之一在這一過程中起了關(guān)鍵作用。研究表明，PSI由至少13種大小差異懸殊的多肽組成，編碼這13種多肽的基因已分別從高等植物和藻類中克隆出來(Chatnis?P?R等1994)，根據(jù)發(fā)現(xiàn)先后，將它們依次命名為psaA～psaN.其中psaA、B、C、，和J存在于葉綠體基因組中，而其余存在于核基因組中(Sumpson?D?J等1989。

迄今，人們已從煙草(Nakamura?M?1994)，菠菜(Steppuhn?J?1989)，水稻(de?Pater?S?1990)和石蒜(江玉梅等2010)等植物中分離出了PsaH?cDNA克隆或核基因克隆，但對(duì)它的基因表達(dá)研究不多。目前還無有關(guān)光合系統(tǒng)I?ZmpsaH基因在玉米上的相關(guān)報(bào)道，

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的內(nèi)容為提供一個(gè)玉米ZmPsaH的基因序列，利用ZmPsaH序列信息擴(kuò)增該基因，并構(gòu)建過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草BY-2細(xì)胞，獲得的轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞系在200mM?NaCL、350mM甘露醇上表現(xiàn)為對(duì)鹽脅迫和滲透脅迫的抗性。

該玉米耐逆基因ZmPsaH核苷酸序列由SEQ?ID?NO：1所定義。該玉米基因ZmPsaH編碼蛋白，其由SEQ?ID?NO：2的氨基酸序列表定義。利用DNA分離技術(shù)獲得耐鹽和抗旱功能顯著提高的植物基因，本發(fā)明還涉及到利用此基因培育轉(zhuǎn)基因耐鹽和抗旱植物中的應(yīng)用。

ZmPsaH基因的克隆：可以采用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成法等多種方法來獲得ZmPsaH基因核苷酸全長序列或其片段。比如，基于ZmPsaH基因序列設(shè)計(jì)多核苷酸探針來從cDNA文庫或基因組文庫中篩選目的基因，也可以用PCR擴(kuò)增方法直接從cDNA或基因組中擴(kuò)增出有關(guān)序列。

玉米ZmPsaH作為目的基因，可以構(gòu)建在任何植物表達(dá)載體的Ti-質(zhì)粒雙元載體中。比如pCAMBIA2301上，其中有LB和RB的T-DNA25bp重復(fù)序列，花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子，polyA?nos終止子，還有在真核生物中作為選擇標(biāo)記使用的卡那霉素。植物表達(dá)載體中的啟動(dòng)子可以是任何一種組成型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子或環(huán)境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如Ubiqutin啟動(dòng)子等。載體中的增強(qiáng)子既可以是轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，也可以是翻譯增強(qiáng)子。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，載體中還應(yīng)有植物可選擇性標(biāo)記(如GUS基因、熒光酶素基因等)或具有抗生素等抗性的標(biāo)記物(如卡那霉素、除草劑等)。

含有ZmPsaH基因片段的重組載體可以轉(zhuǎn)入到一種細(xì)胞或生物體內(nèi)，如細(xì)菌、酵母或植物細(xì)胞進(jìn)行篩選。例如，可以將本發(fā)明得到的基因連接到任何酵母表達(dá)載體如pREP5N上，利用本領(lǐng)域公知的方法如乙酸鋰技術(shù)、電轉(zhuǎn)化法等轉(zhuǎn)化酵母，將酵母轉(zhuǎn)化子涂布在含高濃度NaCl的選擇性培養(yǎng)基平板中，以高鹽為選擇壓力進(jìn)行篩選，確定其耐鹽性的功能驗(yàn)證。