[發明專利]檢測中成藥違法添加雙氯芬酸的免疫膠體金方法

有效

• 申請號: 201310178452.4
• 申請日: 2013-05-15
• 公開（公告）號: CN103267842A
• 公開（公告）日: 2013-08-28
• 發明（設計）人: 郭杰標
• 申請（專利權）人: 郭杰標
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/531
• 代理公司: 韶關市雷門專利事務所 44226
• 代理人: 周勝明

1.一種檢測中成藥違法添加雙氯芬酸的免疫膠體金方法，其特征是以活性酯法將雙氯芬酸與牛血清白蛋白（BSA）偶聯，合成人工免疫抗原，并用于免疫動物，制備特異性抗雙氯芬酸抗體；并將雙氯芬酸與卵清白蛋白（OVA）偶聯，合成檢測抗原，用于構建免疫檢測方法；抗雙氯芬酸抗體經分離純化后標記于納米膠體金，然后和雙氯芬酸檢測抗原以及羊抗兔IgG分別固化在一載體上，根據競爭抑制免疫層析原理，進行雙氯芬酸的半定量分析測定，所建立的檢測體系對保健品、中成藥中違法添加雙氯芬酸的最低檢出限度為2.0μg/kg，能在5分鐘內完成快速檢測；

其中，protein是牛血清白蛋白（BSA）或卵清白蛋白（OVA）。

2.如權利要求1所述檢測中成藥違法添加雙氯芬酸的免疫膠體金方法，其特征在于工藝步驟是：

步驟一：雙氯芬酸人工抗原的制備；

步驟二：抗雙氯芬酸特異性抗體的制備；

步驟三：膠體金的制備；

步驟四：抗雙氯芬酸特異性抗體標記膠體金；

步驟五：硝酸纖維素膜和玻璃纖維素膜的處理；

步驟六：免疫層析試紙條的制備；

步驟七：樣品測試和結果判斷方法。

3.如權利要求2所述檢測中成藥違法添加雙氯芬酸的免疫膠體金方法，其特征是：所述步驟一是采用改良活性酯法分別合成免疫抗原和檢測抗原，其中免疫抗原的合成是將0.?03g雙氯芬酸溶于1.0mL無水二甲基甲酰胺（DMF）中，再加入0.016g二環己基碳二亞胺（DCC）和0.009g?N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），在室溫下反應過夜，離心取上清夜，逐滴加入20mL的15mg/mL的牛血清白蛋白（BSA）碳酸緩沖液（pH值為8.5）中，磁力攪拌反應4小時后，用生理鹽水透析72小時除去未反應的雙氯芬酸，每6小時換透析液一次，分裝凍存于-20°C冰箱，本步驟所合成的雙氯芬酸與牛血清白蛋白（BSA）偶聯物將用作免疫抗原；

其中檢測抗原的合成是將0.?01g雙氯芬酸溶于1.0mL無水二甲基甲酰胺（DMF），再加入0.010g二環己基碳二亞胺（DCC）和0.008g?N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），在室溫下反應過夜，離心取上清夜，逐滴加入20mL的15mg/mL的卵清白蛋白（OVA）碳酸緩沖液（pH值為8.5）中，磁力攪拌反應4小時后，用生理鹽水透析72小時除去未反應的雙氯芬酸，每6小時換透析液一次，分裝凍存于-20°C冰箱，本步驟所合成的雙氯芬酸與卵清白蛋白（OVA）偶聯物將用作檢測抗原。

4.如權利要求2所述檢測中成藥違法添加雙氯芬酸的免疫膠體金方法，其特征是：所述步驟二用合成的免疫抗原對實驗用新西蘭大白兔進行皮下注射免疫，每只大白兔初次免疫用0.2mg/0.2mL免疫抗原加等量的福氏完全佐劑乳化后免疫，初次免疫相隔28天，用0.1mg/0.1mL免疫抗原以福氏不完全佐劑乳化抗原后皮下注射，進行加強免疫，以后每隔21天以同樣劑量加強免疫一次，共進行四次加強免疫，最后一次加強免疫后7天收集血清，-20℃凍存備用。

5.如權利要求2所述檢測中成藥違法添加雙氯芬酸的免疫膠體金方法，其特征是：所述步驟三是在l00mL超純水中加入1.0mL?l%濃度的氯金酸，加熱至沸騰，再加入1%檸檬酸三鈉溶液1mL，繼續煮沸10分鐘，冷卻后，4℃保存備用，取樣掃描測定最大吸收峰并進行透射電鏡觀察粒子大小。

6.如權利要求2所述檢測中成藥違法添加雙氯芬酸的免疫膠體金方法，其特征是：在所述步驟四中，調節如上制備的l00mL膠體金溶液的pH值為8.2，快速攪拌下加入經純化的抗雙氯芬酸抗體400μg，使其終濃度為4μg/mL，室溫反應15分鐘后，加入聚乙二醇PEG至終濃度為1%，繼續攪拌15分鐘，用15000r/min離心30分鐘，吸去上清液后，所得沉淀為純化的金標記抗體，此金標記抗體復懸于保存液中，于4℃保存。

7.如權利要求2所述檢測中成藥違法添加雙氯芬酸的免疫膠體金方法，其特征是：在所述步驟五中，用微定量噴頭噴涂兩條平行線于硝酸纖維素膜上，雙氯芬酸偶聯卵清蛋白結合物作為測試線，羊抗兔IgG作為質控線，用定量噴頭噴涂金標記抗雙氯芬酸抗體于玻璃纖維素膜上，干燥硝酸纖維素膜和玻璃纖維素膜后備用。