[發明專利]一種菲利普胞囊線蟲LAMP檢測引物及檢測方法

有效

• 申請號: 201310178426.1
• 申請日: 2013-05-15
• 公開（公告）號: CN103333951A
• 公開（公告）日: 2013-10-02
• 發明（設計）人: 施艷;王振躍;李洪連;孫炳劍;劉瑞麗;袁虹霞;邢小萍;代君麗
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 鄭州中原專利事務所有限公司 41109
• 代理人: 范之敏

1.一種菲利普胞囊線蟲LAMP檢測引物，其特征在于所述菲利普胞囊線蟲LAMP檢測引物為：

①??FpF3?CTTGGCACCACCACATGC，

?②??FpB3?CTCGCAGCCAAACCTCAG，

?③??FpFIP?GTTGTCCCGTGCCCACAGACCCCCGTCTGCTGTTGAGA，?

④?FpBIP?GGCTACCCTGCGAGCACTCTTGCTCAGCAACGAGTCAGT。

2.根據權利要求1所述的利用菲利普胞囊線蟲LAMP檢測引物的檢測方法，其特征在于：25μl?LAMP反應體系為：包括引物混合液和反應混合液，引物混合液由外引物FpB3、外引物FpF3、內引物FpFIP、內引物FpBIP；反應混合液由dNTP、Tris-HCl、MgSO₄、Trinton?x-100、甜菜堿、DNA聚合酶大片段組成，外引物FpB3???0.2μmol/L、外引物?FpF3??0.2μmol/L、內引物FpFIP??1.6μmol/L、內引物FpBIP??1.6μmol/L；dNTP??10mmol/L、Tris-HCl(pH8.8)???20mmol/L、KCl??10?mmol/L、MgSO_4????5?mmol/L、(NH₄)₂SO_4???10?mmol/L、Trinton?x-100??0.1%、甜菜堿?0.1mol/L、DNA聚合酶大片段???8U?Bst；模板DNA?1?μl，余量為滅菌雙蒸餾水，將引物混合液和反應混合液混勻后加入模板DNA，再加入滅菌雙蒸餾水，60~65℃保溫30~90min，82℃保溫10min，然后加入2?μL顯色劑，所述顯色劑為SYBR?Green?I與PCR級DMSO的混合物，SYBR?Green?I與PCR級DMSO的體積比為1：9。

3.根據權利要求2所述的菲利普胞囊線蟲LAMP的檢測方法，所述DNA模板的提取方法為：

（1）將單個菲利普胞囊線蟲孢囊放入已滅菌的PCR管中，加入14μl?ddH₂O，-20℃冷凍2h；

（2）取出PCR管，進行研磨，使菲利普胞囊線蟲破碎，然后加入3μl蛋白酶K溶液（600μg/ml）和3μl?10×PCR?buffer，再放入-20℃冷凍2h；

（3）將PCR管放入65℃水浴鍋中，水浴加熱1h，然后95℃加熱10min使蛋白酶K變性；

（4）13000r/min離心2min，將上清轉到新的PCR管中。