[發(fā)明專利]利用DFNA5基因調(diào)控區(qū)兩個甲基化位點作為乳腺癌早期分子篩查的標(biāo)記物

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310178184.6
• 申請日: 2013-05-15
• 公開（公告）號: CN104152539A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李艾斯
• 申請（專利權(quán)）人: 南京邁達(dá)醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

所屬技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種乳腺癌早期分子篩查的標(biāo)記物。DFNA5基因調(diào)控區(qū)兩個甲基化位點可用于乳腺癌早期篩查的一個預(yù)警標(biāo)記。?

背景技術(shù)

乳腺癌是全球婦女最常見的惡性腫瘤，定期的乳腺X線檢查可以降低40歲以上婦女乳腺癌的死亡率，因此是迄今為止唯一證實有效的乳腺普查措施。盡管乳腺X線檢查在乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)中具有較高的應(yīng)用價值，但它可能存在漏診，而且在判斷異常病灶的良惡性方面的應(yīng)用價值也十分有限，目前對于乳腺X線普查間歇期內(nèi)發(fā)生乳腺癌是漏診還是新發(fā)生的病例尚無有效的區(qū)分方法。所以，一種簡單、迅速、廉價的乳腺癌早期篩查方法將會為中國數(shù)以億計的婦女造福。?

DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，它是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA?methyl-transferase，Dnmt)催化S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶(mC)的一種反應(yīng)，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化學(xué)性修飾堿基。CG二核苷酸是最主要的甲基化位點，它在基因組中呈不均勻分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的區(qū)域，在哺乳動物中mC約占C總量的2-7％。一般說來，DNA的甲基化會抑制基因的表達(dá)。甲基化的模式是當(dāng)前研究的重要課題。在正常組織內(nèi)，基因的甲基化主要分布在缺少CpG位點的編碼區(qū)。?

腫瘤的特征是不平衡的甲基化。在腫瘤中，伴隨基因組的低甲基化是區(qū)域性的高甲基化，及DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的基因表現(xiàn)上升。有證據(jù)顯示基因組的低甲基化可以導(dǎo)致染色體的不穩(wěn)定及增加突變機會，在細(xì)胞中的整體甲基化狀態(tài)可能是引發(fā)癌癥的促進(jìn)因素。某些基因的甲基化狀態(tài)會是腫瘤生成的生物標(biāo)志，比如說，谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶Pi基因的甲基化已被建議作為前列腺癌的診斷指標(biāo)。環(huán)境因素(廚房油煙，汽車尾氣等)會改變表觀遺傳形狀(CpG甲基化或去甲基化)，造成基因不正常的表達(dá)或沉默。普遍認(rèn)為，這種變化可能與癌癥的起因有直接的關(guān)系。?

我們認(rèn)為，DFNA5基因調(diào)控區(qū)CpG的甲基化程度與乳腺癌的發(fā)病有直接關(guān)系，可能成為早期乳腺癌分子篩查的分子標(biāo)記物。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明利用Illumina芯片對人全基因組27332個CpG位點的甲基化狀況進(jìn)行探測，用兩個乳腺癌細(xì)胞系進(jìn)行掃描得出結(jié)果。如下表所示，數(shù)據(jù)顯示DFNA5基因調(diào)控區(qū)CpG的甲基化程度明顯低于其它基因調(diào)控區(qū)的CpG島。我們認(rèn)為，這種低甲基化與乳腺癌細(xì)胞的快速生長有密切關(guān)系。因此，我們可能通過檢測此CpG島的甲基化程度，預(yù)警乳腺癌的發(fā)病。?

本發(fā)明所述兩個甲基化位點在人基因組的位置(DNFA5基因Exon1在人第七染色體上的位置)如下：?

DNFA5Exon1(Chromosome7)：?

Start?position24，763，851?

End?position24，764，165?

cg24805239：?

CpG?position24，764，011?

SourceSeq：?

CGGTTCAACCAGGAAAGTCCAAGGCCTGTCCAGCCTGTGGGAGCCCCTAA?

cg04770504：?

CpG?position24,763,888?

SourceSeq：?

TCGGGACTCACCCGGGAGATGTCGGGGCCTCTCGGGAAGAGTGGGCTGCG?

具體實施方式

DNA甲基化：是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶的表觀遺傳修飾，常見于基因的5′-CG-3′序列，它在人的正常發(fā)育、X染色體失活、衰老、腫瘤及許多疾病過程中發(fā)揮重要作用。?

Infinium?Methylation?Assay：利用重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化胞嘧啶→尿嘧啶原理檢測gDNA是否被甲基化。重亞硫酸鹽作用于gDNA后，gDNA中未被甲基化的胞嘧啶將轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ呀?jīng)甲基化的胞嘧啶仍然保持原樣。Infinium?Methylation?Assay設(shè)計的兩條位點特異性探針，一條與甲基化的位點配對，一條與未甲基化的位點配對，配對后的探針單堿基延伸，隨后熒光試劑染色，gDNA甲基化程度就可以通過捕捉到的熒光信號來判斷。?

Day1：?

Start?Bisulfite?Conversion?

事先準(zhǔn)備工作：?