[發明專利]禽流感H7N9病毒RT-PCR檢測試劑盒及檢測方法

無效

• 申請號: 201310176383.3
• 申請日: 2013-05-10
• 公開（公告）號: CN103276109A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 張嚴峻;李輝;茅海燕
• 申請（專利權）人: 浙江省疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 杭州九洲專利事務所有限公司 33101
• 代理人: 王洪新

1.禽流感H7N9病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，包括脫氧三磷酸核苷、MgCl₂、RT-PCR緩沖液、禽流感H7N9病毒基因標準品、RNA酶抑制劑、MMLV逆轉錄酶以及DNA聚合酶；其特征在于所述檢測試劑盒還包括上游引物、下游引物和特異性探針，所述上游引物、下游引物和特異性探針的序列如下：

上游引物H7-FP:5’-CACTGCARAATAGAATACAGATWGAC-3’；

下游引物H7-RP:5’-GTGCACYGCATGTTTCCATT-3’；

特異性探針H7-P:5’-FAM-TTATGGTTTAGCTTCGGGGCATCATG-BHQ1-3’，其中FAM-為熒光報告基團，BHQ1為熒光淬滅基團；

上游引物N9-FP:5’-ACAATACACGATAGRTCCCAGTA-3’；

下游引物N9-RP:5’-CTAGTACTTGACCACCCAATGC-3’；

特異性探針N9-P:5’-HEX-CTRTCATCACCRCCCACAGTGTA-BHQ1-3’，其中FAM-為熒光報告基團，BHQ1為熒光淬滅基團；

所述禽流感H7N9病毒基因標準品的序列如下：

TGCAGAATAGAATACAGATAAACCCAGTGAAGTTGAGTAGTGGATACAAA?

GACATAATCTTATGGTTTAGCTTCGGGGCATCATGTTTCCTTCTTATAGCCAT?

TGCAATGGGATTGGTTTTCATTTGCATAAAGAATGGAAACATGCGGTGGTT?

CTATGCTCTCAGCCAAGGAACAACAATCAGAGGGAAACACTCAAACGGAA?

CAATACACGATAGGTCCCAGTATCGCGCCCTGATAAGCTGGCCACTATCATC?

ACCGCCCACAGTGTACAATAGCAGGGTGGAATGCATTGGGTGGTCAAGTA?

CTAGTTGCCATGATGG。

2.根據權利要求1所述的禽流感H7N9病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于所述檢測試劑盒中各組分的含量是：

3.根據權利要求2所述的禽流感H7N9病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于所述緩沖液PCR緩沖液是2×One?Step?RT-PCR?Reaction?Buffer。

4.一種禽流感H7N9病毒熒光定量RT-PCR檢測方法，按以下步驟進行：

（1）提取待測樣品RNA；

（2）以待測樣品RNA為模板，與下列物質混合配制成反應體系進行RT-

PCR反應：上游引物、下游引物、特異性探針、RT-PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷、MgCl₂、RNA酶抑制劑、MMLV逆轉錄酶、DNA聚合酶；

所述特異性引物和熒光探針序列如下：

上游引物H7-FP:5’-CACTGCARAATAGAATACAGATWGAC-3’

下游引物H7-RP:5’-GTGCACYGCATGTTTCCATT-3’

特異性探針H7-P:5’-FAM-TTATGGTTTAGCTTCGGGGCATCATG-BHQ1-3’

上游引物N9-FP:5’-ACAATACACGATAGRTCCCAGTA-3’

下游引物N9-RP:5’-CTAGTACTTGACCACCCAATGC-3’

特異性探針N9-P:5’-HEX-CTRTCATCACCRCCCACAGTGTA-BHQ1-3’

（3）對RT-PCR反應產物進行熒光檢測，根據熒光檢測的最低Ct值和最高熒光強度判斷結果，若RT-PCR反應產物的熒光檢測結果呈陽性，則待測樣品含有禽流感H7型病毒。

5.根據權利要求4所述的禽流感H7N9病毒熒光定量RT-PCR檢測方法，其特征在于所述步驟（2）中PCR反應體系中各成分含量如下：

其余是DEPC水，將反應體系補足至25μl。

6.根據權利要求5所述的禽流感H7N9病毒熒光定量RT-PCR檢測方法，其特征在于所述熒光定量RT-PCR反應條件為：50℃40min，95℃2min進行逆轉錄，然后95℃10s，55℃35s，在55℃進行單點熒光檢測，共進行40個循環。