[發明專利]禽流感病毒H7型RT-PCR檢測試劑盒及檢測方法

無效

• 申請號: 201310175739.1
• 申請日: 2013-05-10
• 公開（公告）號: CN103276108A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 夏時暢;張嚴峻;李輝
• 申請（專利權）人: 浙江省疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 杭州九洲專利事務所有限公司 33101
• 代理人: 王洪新

技術領域

本發明涉及禽流感病毒H7型核酸熒光定量RT-PCR檢測試劑盒及檢測方法，可應用于禽流感病毒H7型引起暴發疫情的實驗室應急檢測。

背景技術

禽流感病毒屬正粘病毒科甲型流感病毒屬。禽甲型流感病毒顆粒呈多形性，其中球形直徑80～120nm，有囊膜。基因組為分節段單股負鏈RNA。依據其外膜血凝素（H）和神經氨酸酶（N）蛋白抗原性不同，目前可分為16個H亞型（H1～H16）和9個N亞型（N1～N9）。禽甲型流感病毒除感染禽外，還可感染人、豬、馬、水貂和海洋哺乳動物。以往研究發現可感染人的禽流感病毒亞型為H5N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3。目前，全球首次發現人感染H7N9禽流感病毒。人感染H7N9禽流感是由H7N9亞型禽流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。據報道，自2013年2月以來，我國上海市、安徽省、江蘇省先后發生不明原因重癥肺炎病例，其中確診人感染H7N9禽流感3例，2例死亡。3例均為散發病例，目前尚未發現3例病例間有流行病學關聯。此次報道的為人感染H7N9禽流感病毒。該病毒為新型重配病毒，其內部基因來自于H9N2禽流感病毒。

流行病學調查顯示H9N2禽流感病毒的傳染源目前尚不明確，根據以往經驗及本次病例流行病學調查，推測可能為攜帶H7N9禽流感病毒的禽類及其分泌物或排泄物。H7N9禽流感病毒經呼吸道傳播，也可通過密切接觸感染的禽類分泌物或排泄物等被感染，直接接觸病毒也可被感染，現尚無人與人之間傳播的確切證據。根據流感的潛伏期及現有H7N9禽流感病毒感染病例的調查結果，潛伏期一般為7天以內。患者一般表現為流感樣癥狀，如發熱，咳嗽，少痰，可伴有頭痛、肌肉酸痛和全身不適。重癥患者病情發展迅速，表現為重癥肺炎，體溫大多持續在39℃以上，出現呼吸困難，可伴有咯血痰；可快速進展出現急性呼吸窘迫綜合征、縱隔氣腫、膿毒癥、休克、意識障礙及急性腎損傷等。

根據流行病學調查結果發現，H7N9禽流感病毒感染致死率較高，且暫時并沒有相應的保護性疫苗可供使用。因此，疾病防控機構強烈需要快速、有效的H7N9禽流感病毒檢測方法來加強對禽流感感染疑似病例及相關禽類中的H7N9禽流感病毒檢測，從而提高我們對H7N9禽流感病毒感染的防制能力。目前，實驗室病原學檢測方法主要是病毒分離：從患者呼吸道標本中分離H7N9禽流感病毒。上述檢測方法的不足是檢測速度尚不能滿足要求（通常需要5天左右）；而且操作比較復雜。

發明內容

本發明的目的是提供一種禽流感病毒H7型的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，該檢測試劑盒應具有使用方便、檢測準確的特點。

本發明的另一目的是提供一種禽流感病毒H7型的熒光定量RT-PCR檢測方法，該方法應具有檢測準確性高、檢測簡單方便的特點。

本發明采用的技術方案是：

禽流感病毒H7型熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，包括脫氧三磷酸核苷、MgCl₂、RT-PCR緩沖液、禽流感病毒H7基因標準品、RNA酶抑制劑、MMLV逆轉錄酶以及DNA聚合酶；其特征在于所述熒光定量RT-PCR檢測試劑盒還包括上游引物、下游引物和特異性探針，所述上游引物、下游引物和特異性探針的序列如下：

上游引物H7-FP:5’-CACTGCARAATAGAATACAGATWGAC-3’

下游引物H7-RP:5’-GTGCACYGCATGTTTCCATT-3’

探針特異性H7-P:5’-FAM-TTATGGTTTAGCTTCGGGGCATCATG-BHQ1-3’，其中FAM-為熒光報告基團，BHQ1為熒光淬滅基團；

所述流感病毒H7基因標準品的序列如下：

CAATGCAAAATAGAATACAGATTGACCCAGTCAAACTAAGCAGCGGCTACAAAGATGTGATACTCTGG?TTTAGCTTCGGGGCATCATGTTTCATACTTCTAGCCATTGCAATGGGCCTTGTTTTCATATGTGTGAA?GAATGGAAACATGCGGTGCAC。

所述檢測試劑盒中各組分的含量是：

一種禽流感病毒H7型熒光定量RT-PCR檢測方法，按以下步驟進行：

（1）提取待測樣品RNA；

（2）以待測樣品RNA為模板，與下列物質混合配制成反應體系進行RT-PCR反應：上游引物、下游引物、特異性探針、RT-PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷、MgCl2、RNA酶抑制劑、MMLV逆轉錄酶、DNA聚合酶；

所述特異性引物和特異性探針序列如下：