[發(fā)明專利]一種檢測藥物包裹或釋放過程的單分子分析方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310174666.4
• 申請日: 2013-05-14
• 公開（公告）號(hào): CN103267785A
• 公開（公告）日: 2013-08-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬娜;張亞妮;亢曉峰
• 申請（專利權(quán)）人: 西北大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N27/26
• 分類號(hào): G01N27/26
• 代理公司: 西安西達(dá)專利代理有限責(zé)任公司 61202
• 代理人: 謝鋼

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測藥物包裹或釋放過程的單分子分析方法，屬于單分子分析技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

環(huán)糊精分子呈環(huán)形籠狀結(jié)構(gòu)，外表面具有很強(qiáng)的親水性，內(nèi)部空腔具有很強(qiáng)的疏水性，這種特殊結(jié)構(gòu)和性質(zhì)使它在醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，主要包括改善藥物的水溶性，作為藥物載體或賦型劑通過主-客體相互作用包裹疏水性藥物分子等。客體藥物活性分子能夠通過疏水作用力、范德華力和氫鍵等嵌入β-環(huán)糊精疏水內(nèi)腔，形成單分子包合體分子膠囊。因?yàn)榇蠖鄶?shù)藥物難溶于水，所以環(huán)糊精作為藥物分子載體在臨床醫(yī)學(xué)上應(yīng)用較廣。目前，已經(jīng)有大量的環(huán)糊精類藥物包裹體問世，例如廣譜抗菌劑甲氧芐氨嘧啶溶解度較低，且伴有苦味，這阻礙了其在臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面的推廣和研究，經(jīng)β-環(huán)糊精包裹后有效地去除了苦味，改善了氣味，并且溶解度顯著增大。又例如α、β受體阻斷劑卡維地洛(1-(9H-咔唑-4-氧基)-3-[2-(2-甲氧基苯氧基)乙基氨基]-2-丙醇)具有舒張血管的作用，可用于治療腎功能不全、糖尿病患者的高血壓等癥狀，但其溶解度低，嚴(yán)重影響了藥效的發(fā)揮。卡維地洛/β-CD藥物包裹體溶解度大幅增加，從而藥效顯著提高。

傳統(tǒng)研究藥物包裹或釋放過程的方法主要采用紫外-可見分光光度法和熒光分光光度法。但上述方法靈敏度低，檢測分析中易受光散射等因素的影響，只能在宏觀層面上研究藥物的包裹或釋放，分析速度慢，藥物包裹體的制備、表征以及藥物釋放動(dòng)力學(xué)的研究所需時(shí)間較長，不能對環(huán)糊精和藥物分子同時(shí)進(jìn)行原位實(shí)時(shí)分析，檢測范圍小，受限于藥物分子的光學(xué)吸收特征，因此急需發(fā)展一種單分子水平的檢測手段。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種檢測靈敏度高，并可對藥物分子同時(shí)進(jìn)行原位實(shí)時(shí)分析的檢測藥物包裹或釋放過程的單分子分析方法，可動(dòng)態(tài)仿真模擬藥物在體內(nèi)的釋放機(jī)理和作用機(jī)制。

本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)過程如下：

一種檢測藥物包裹或釋放過程的單分子分析方法，包括以下步驟：

（1）在電解池順式加入α-溶血素蛋白質(zhì)雙突變體(M113F/K147N)₇，雙突變體(M113F/K147N)₇插于脂雙層形成蛋白質(zhì)納米單通道；

（2）在電解池反式依次加入環(huán)糊精和藥物分子，記錄加入藥物分子前后單通道電流的變化，當(dāng)在環(huán)糊精造成的電流阻塞基礎(chǔ)上出現(xiàn)二次電流阻塞水平臺(tái)即證明藥物包裹體的形成，電流變化呈三態(tài)P-Drug、P-βCD和P-βCD-Drug。

一種檢測藥物包裹或釋放過程的單分子分析方法，包括以下步驟：

（1）在電解池順式加入α-溶血素蛋白質(zhì)雙突變體(M113F/K147N)₇，雙突變體(M113F/K147N)₇插于脂雙層形成蛋白質(zhì)納米單通道；

（2）在電解池反式加入環(huán)糊精藥物包裹體，記錄蛋白質(zhì)納米單通道電流的變化，當(dāng)環(huán)糊精藥物包裹體釋放的自由藥物分子和環(huán)糊精分子在蛋白質(zhì)納米單通道內(nèi)發(fā)生單分子鍵合再次形成環(huán)糊精藥物包裹體時(shí)，單通道電流出現(xiàn)二次電流阻塞水平臺(tái)即證明藥物包裹體的再次形成，電流變化呈三態(tài)P-Drug、P-βCD和P-βCD-Drug。

根據(jù)上述方法，可將天然α-溶血素蛋白質(zhì)雙突變體(M113F/K147N)₇用于藥物分子包裹或釋放過程的原位動(dòng)力學(xué)過程分析以及用于藥物分子包裹或釋放過程機(jī)理研究，所述的藥物分子包括合成藥物或天然藥物、氣味劑、食品添加劑或化妝品成份。

天然α-溶血素納米通道傳感器對環(huán)糊精分子以及奧美拉唑和鹽酸阿霉素等無響應(yīng)或響應(yīng)很弱，為此本發(fā)明設(shè)計(jì)并制備了113位和147位的雙突變體(M113F/K147N)₇納米通道傳感器(蛋氨酸M突變?yōu)楸奖彼酕，賴氨酸K突變?yōu)樘於彼酦，見圖1)。雙突變不僅可極大地增強(qiáng)環(huán)糊精分子在納米通道中的鍵合和藥物分子在納米通道中的直接鍵合，且允許自由藥物分子、β環(huán)糊精分子和藥物/環(huán)糊精復(fù)合物的同時(shí)檢測，可方便地實(shí)現(xiàn)單分子水平藥物包裹和釋放過程的動(dòng)力學(xué)研究。?

本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)和積極效果為：

（1）本發(fā)明檢測環(huán)糊精/藥物體系的方法是單分子方法，與現(xiàn)有基于宏觀層面分子聚集行為的藥物檢測方法(如紫外-可見分光光度法，熒光分光光度法等)不同，具有很高的檢測靈敏度；

（2）本發(fā)明可同時(shí)檢測環(huán)糊精載體和藥物分子二者及其動(dòng)態(tài)變化，這是其它技術(shù)很難達(dá)到的；