[發明專利]一種α轉移葡萄糖苷酶及表達α轉移葡萄糖苷酶的菌株

在審

• 申請號: 201310174073.8
• 申請日: 2013-05-13
• 公開（公告）號: CN104152422A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發明（設計）人: 王華明;訾禎禎
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12P19/18;C12N1/15;C12R1/685;C12R1/66
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

技術領域

本發明屬于酶篩選和重組表達技術領域，具體涉及一種種來源于棒曲霉(Aspergillus?clavatus)的α轉移葡萄糖苷酶，以及該α轉移葡萄糖苷酶在絲狀真菌宿主細胞中的異源表達。

背景技術

α轉移葡萄糖苷酶(α-transglucosidase?E.C.2.4.1.24)能夠從低聚糖類底物的非還原性末端切開α-1、4糖苷鍵，釋放出葡萄糖，或將游離出的葡萄糖殘基以α-1、6糖苷鍵轉移到另一個糖類底物上，從而得到非發酵性的低聚異麥芽糖(簡稱IMO，主要包括異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖等)、糖脂或糖肽等。該酶既具有水解能力，又可以專一地進行葡萄糖苷鍵的轉移反應，是生產低聚異麥芽糖的必需酶制劑之一。

α轉移葡萄糖苷酶在自然界中分布廣泛，種類繁多，性質各異，幾乎存在于所有生物體內，在人類的糖原降解及動物、植物和微生物的糖類代謝方面具有重要的生理功能。α轉移葡萄糖苷酶主要應用于生產IMO，而IMO是人類腸道有益菌群雙歧桿菌的增殖因子，攝入后不被人體消化吸收，也不易被大腸中的多數腐敗細菌所利用，卻能作為雙歧桿菌的碳源而被利用。因此作為一種功能性食品原料，IMO已被廣泛用在各種食品的制造，居各種功能性低聚糖之首。

目前工業上已經有以淀粉或麥芽糖為原料，通過酶法生產低聚異麥芽糖的工藝，但是已有的生產工藝轉化率并不高。此外，雖然我國異麥芽糖產量很高，α轉移葡萄糖苷酶的用量很大，但是沒有工業化生產，該酶仍然依賴進口。因此，本領域亟需獲得高純度的轉化活性較高的低聚異麥芽糖，提高生產工藝的轉化效率；也亟需獲得相應的高活性的α轉移葡萄糖苷酶及其相應的生產菌株。

發明內容

本發明的目的是提供一種α轉移葡萄糖苷酶及表達α轉移葡萄糖苷酶的菌株，從而彌補現有技術的不足。

本發明一個方面提供一種α轉移葡萄糖苷酶，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1。

本發明的另一個方面提供用于編碼上述α轉移葡萄糖苷酶的基因，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO:2。

本發明的α轉移葡萄糖苷酶，是從棒曲霉(Aspergillus?clavatus)中擴增出的。

本發明還提供用于表達上述α轉移葡萄糖苷酶的曲霉菌株；

一種表達α轉移葡萄糖苷酶的黑曲霉（Asperillus?niger）Ac4，已于2013年4月7日保存于位于北京市朝陽區北辰西路1號院3號的中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），菌株編號為CGMCC?No.7417。

本發明的α轉移葡萄糖苷酶和重組黑曲霉菌株用于生產低聚異麥芽糖。

本發明所得到的重組菌種能夠高效的表達α轉移葡萄糖苷酶，且其酶活力大大高于其在野生菌中的酶活，也高于宿主菌黑曲霉自身表達的α轉移葡萄糖苷酶的酶活力。同時，所得重組的α轉移葡萄糖苷酶是由食品安全菌（GRAS）黑曲霉分泌所得，擴大了α轉移葡萄糖苷酶的應用領域。

附圖說明

圖1：本發明所構建的pGm-Ac4的質粒圖譜；

圖2：本發明重組菌株的代謝產物的蛋白SDS-PAGE凝膠圖，顯示了黑曲霉轉化子Ac4的表達情況，以及野生菌和宿主菌黑曲霉G1的蛋白表達情況，其中泳道1所示為蛋白標準分子量標記，由上至下為116.0kD，66.2kD，45.0kD，35.0kD，25.0kD和18.4kD；泳道2所示為黑曲霉宿主G1在發酵5d后的蛋白表達情況；泳道3所示為Ac4的α轉移葡萄糖苷酶表達情況，在109kDa處可以看到清晰蛋白條帶；泳道4所示為野生菌的蛋白表達情況，其無可檢測到的蛋白表達。

具體實施方式

本發明用到了在遺傳工程和分子生物學領域使用的常規技術和方法。例如MOLECULAR?CLONING:A?LABORATORY?MANUAL,3nd?Ed.(Sambrook,2001)和CURRENT?PROTOCOLS?IN?MOLECULAR?BIOLOGY(Ausubel,2003)等參考書中所記載的技術。但是，這并不意味著將本發明限定于所述的任何具體方法、實驗方案和試劑，本領域的普通技術人員可以選用已公開的技術來實施本發明實施例中記載的方案。

本發明中，核酸是按5′至3′方向從左至右書寫；氨基酸是按氨基至羧基的方向從左至右書寫。

對于本發明中所涉及到各個名詞，其具體的定義如下：