[發(fā)明專利]豚鼠切齒中DSPP基因的實時熒光定量PCR的檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310174041.8
• 申請日: 2013-05-13
• 公開（公告）號: CN103233076A
• 公開（公告）日: 2013-08-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 韓天龍;李志明;王敏;趙瑞霞;黃國成;李清泉
• 申請（專利權(quán)）人: 赤峰市農(nóng)牧科學研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 赤峰市專利事務(wù)所 15103
• 代理人: 劉峰

1.一種豚鼠切齒中DSPP基因的實時熒光定量PCR的檢測方法，其特征在于：它由如下步驟組成：

A、樣本的準備：快速拔取牙齒，除凈附著的牙齦組織，以4℃滅菌生理鹽水反復沖洗，用滅菌濾紙吸干，迅速將牙齒用滅菌咬骨鉗截成小塊，放入液氮中進行低溫冷凍脆化處理24～48?h；

B、設(shè)計引物：根據(jù)Genbank中豚鼠的β-actin基因和大鼠的DSPP基因的mRNA序列設(shè)計相應的引物，

β-actin基因擴增時使用的引物為：

上游引物：5’-AGCAGATGTGGATCAGCAAG-3’

下游引物：5’-AAGGGTGTAACGCAGCAAAG-3’

DSPP基因擴增時使用的引物為：

上游引物：5’-GTTAGTGCCGCTGGAGAGAG-3’

下游引物：5’-ATCGTCGTTAGTGGCGTTG-3’

C、提取總RNA：從液氮中取牙齒小塊150～200?mg，進行液氮研磨，一般研磨14～16?min；收集研磨好的牙齒組織粉末，加入到預先加有1?ml裂解液的預冷5?ml離心管中，在冰浴下以轉(zhuǎn)速3000?r/min進行間歇性勻漿2～3?min；轉(zhuǎn)入2.0?ml的離心管中，25℃溫浴靜置5?min；加入0.2ml氯仿，在旋渦振蕩器上旋渦振蕩15?s，25℃溫浴靜置3?min；在4℃下以12000?g離心15?min；收集上清，加入0.5?ml異丙醇，25℃溫浴靜置10?min；在4℃下以12000?g離心10?min；棄去上層懸液，加入1?ml?75%乙醇溶液，旋渦振蕩洗脫，在4℃下以7500?g離心5?min；棄上清，干燥RNA沉淀5～10?min，加入10?μl的0.1%DEPC處理水，于55～60℃下進行加熱10?min，分裝后保存于－80℃；

D、反應體系的建立：RT-PCR反應體系組成包括：總RNA模板、上下游引物、Buffer、反轉(zhuǎn)錄酶、熒光染料；建立20?μl的反應體系；

E、反應條件的優(yōu)化：參照引物的TM值，通過擴增曲線和熔解曲線分析，確定最佳的引物濃度、退火溫度和時間以及總RNA模板添加量；本發(fā)明采用的反應條件為：95℃預變性10?s，95℃變性5?s，58℃退火20?s，72℃延伸6?s；共40個循環(huán)；

F、標準曲線的制作：用RNase?Free超純水將總RNA稀釋到0.2?μg/μl，作為濃度最高的模板（2⁰，1號）。然后取11個容量為150?μl的EP聯(lián)管（2-12號），分別加入10?μl?RNase?Free超純水。從1號中取10?μl加入到2號管中，稀釋倍數(shù)為2，依次類推；將1號逐級2倍稀釋成2^-1、2^-2、2^-3、2^-4、2^-5、2^-6、2^-7、2^-8、2^-9、2^-10、2^-11，用于標準曲線的制作；

G、熒光定量分析：針對看家基因和目的基因，每個樣本在每次反應中，要至少做3次重復，取平均值，根據(jù)Ct值，從標準曲線上讀取相應的模板濃度；樣本目的基因的相對表達量等于目的基因的表達量均值除以看家基因表達量均值。