[發(fā)明專利]枸杞細胞質抗壞血酸過氧化物酶基因及應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310173985.3
• 申請日: 2013-05-13
• 公開（公告）號: CN103305538A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發(fā)明（設計）人: 王罡;季靜;吳廣霞;關春峰;張旭強
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/08;C12N15/63;C12N1/21;C12N5/10;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 王小靜

技術領域

本發(fā)明涉及一種枸杞（Lycium?chinense?Miller）細胞質中抗壞血酸過氧化物酶基因LmAPX的克隆，具體為一種枸杞細胞質抗壞血酸過氧化物酶基因及應用。

背景技術

抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate?peroxidase，APX，EC1.11.1.11）是一種亞鐵血紅素蛋白，也叫做維生素C過氧化物酶，它屬于末端氧化酶的一種，主要存在于高等植物、真核藻類及某些藍細菌中，但在某些昆蟲中也檢測到該酶活性。APX是清除H₂O₂的關鍵酶，以還原型抗壞血酸為反應底物，它催化H₂O₂還原為H₂O的反應，對抗壞血酸具有很高的特異性和親和性，消耗H₂O₂產生單脫氫抗壞血酸，單脫氫抗壞血酸可通過不同的途徑被還原成抗壞血酸(AsAda,?1992;?Shigeoka?et?al.,1980a;?1980b)。在高等植物中，APX是一個多基因家族，根據其在細胞內的定位不同可分為：葉綠體中的基質APX(sAPX)、類囊體膜APX(tAPX)、微體(乙醛酸循環(huán)體和過氧化物酶體)膜結合型APX(mAPX)、胞質APX(cAPX)和線粒體APX(mitAPX)。

APX的分子和酶學特點不同于其它的血紅素過氧化物酶。APX對電子供體AsA具有高度的特異性，尤其是葉綠體APX(chlAPX)和mitAPX。APX的一個最大特點是在沒有電子供體AsA時很不穩(wěn)定，AsA低于20μmol/L時APX的活性迅速降低，適當內源濃度的AsA(≥20?mol/L)對于APX作用的發(fā)揮至關重要，這不僅表明AsA可以調節(jié)APX的活性，而且為AsA作為植物重要的抗氧化劑提供了證據。

在逆境條件(鹽漬、干旱、高溫、低溫、真菌侵染等)下，植物由于細胞代謝過程不協調會導致各種活性氧的升高從而造成氧化脅迫。氧化脅迫是由ROS，如單線態(tài)的氧、超氧負離子、過氧化氫及羥自由基的形成導致的。過量的ROS對植物細胞具有較強的毒害作用，使細胞產生細胞水平和分子水平上的不可逆損傷，膜系統遭到破壞，導致組織結構和細胞區(qū)隔化喪失，胞膜系統產生變性，最終導致細胞損傷和死亡。APX在植物生長發(fā)育和逆境脅迫響應等生理過程中都發(fā)揮著非常重要的作用，尤其是植物受到逆境脅迫時，APX可以快速清除細胞中產生的過量的H₂O₂，對于保護葉綠體和其他細胞組分免受H₂O₂及其所產生的羥自由基的破壞是必不可少的。APX能提高氧化耐受性的作用已在許多植物中有報道，目前多種植物的APX基因已克隆并應用于植物轉基因的研究（孫衛(wèi)紅等，2005）。由于APX在清除ROS、抵抗逆境脅迫方面具有重要作用，植物體內主要的過氧化物清除酶APX已成為當今植物耐逆性研究中的一個熱點。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種枸杞細胞質抗壞血酸過氧化物酶基因。

本發(fā)明的第二個目的是提供該基因編碼的蛋白質。

本發(fā)明的目的還在于提供含有該基因的重組載體和宿主細胞。

本發(fā)明的另一個目的在于提供該基因的用途。

本發(fā)明提供了一種枸杞細胞質抗壞血酸過氧化物酶基因LmAPX，如序列表中SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列構成。

本發(fā)明提供了一種上述枸杞細胞質抗壞血酸過氧化物酶基因LmAPX編碼的蛋白質，如序列表中SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列的蛋白質。

本發(fā)明提供了一種上述枸杞細胞質抗壞血酸過氧化物酶基因LmAPX重組克隆載體pMD18-T-LmAPX。

本發(fā)明提供了一種上述枸杞細胞質抗壞血酸過氧化物酶基因LmAPX重組植物表達載體pCAMBIA2300-?LmAPX。

含有上述的枸杞細胞質抗壞血酸過氧化物酶基因LmAPX的重組載體，這些重組載體包括質粒。

所述的質粒表達載體大腸桿菌表達載體pET28a-LmAPX。

所述的質粒表達載體雙元植物表達載體pCAMBIA2300-?LmAPX。

含有上述枸杞細胞質抗壞血酸過氧化物酶基因LmAPX完整編碼閱讀框序列的宿主細胞，如含有上述重組載體的宿主細胞也屬于本發(fā)明的保護范圍。

所述的宿主細胞選自大腸桿菌細胞、農桿菌細胞或煙草細胞。