[發明專利]miR-290家族在小鼠胚胎干細胞中的調控作用

無效

• 申請號: 201310172321.5
• 申請日: 2013-05-10
• 公開（公告）號: CN103285404A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 金由辛;趙波濤;龔自珍;翁鳴;馬中良
• 申請（專利權）人: 上海大學
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61P35/00;C12N15/113;C12N5/0735
• 代理公司: 上海上大專利事務所(普通合伙) 31205
• 代理人: 陸聰明

技術領域

本發明涉及一種miR-290家族在小鼠胚胎干細胞中的調控作用。

背景技術

微RNA(?microRNA?,?miRNA?)功能調控是當前生命科學的重要前沿。微RNA?(microRNA,?miRNA)是一類約22?nt的非編碼小分子RNA，廣泛存在于較高等的真核生物中，大多具有較高的保守性。miRNA作用于特異的mRNA，多使其降解或抑制其翻譯，在轉錄后水平負調控基因表達，而有些miRNA則可以激活靶基因的轉錄。成熟的miRNA的5′端第2~7位堿基被稱為“種子序列”，是有效調控mRNA的關鍵，miRNA的結合位點不僅可以是靶基因的3′-UTR，也可以是靶基因的5′-UTR或者CDS區域。在哺乳動物中，約30%的蛋白質編碼基因受到miRNA的調控。

miRNA在ESC自我更新、多向分化潛能、以及早期分化中起到的重要作用受到了廣泛關注。胚胎干細胞是來自于囊胚期胚胎內細胞團，具有無限的自我更新能力和分化成各種細胞類型的潛能，簡稱為“干性”。基于其獨特的生物學特性，胚胎干細胞不僅能夠作為體外研究生物發育機制、體細胞重編程、癌癥永生化的模型，而且可以分化成特異細胞以代替受傷細胞或生成再生組織，具有極高的醫學研究價值。近年來，在小鼠胚胎干細胞(mouse?Embryonic?Stem?Cell,?mESC)中特異且高表達的miR-290家簇成為研究的焦點。miR-290家簇在mESC的細胞周期，甲基化過程以及抗凋亡機制中起到重要的調控作用，并且參與到多功能轉錄因子調控網絡中，成為mESC自我更新和分化潛能維持的重要的調控因子。開展miR-290家簇研究不僅有助于了解mESC早期發育機制，促進其在醫療領域的應用，而且也有助于iPS機制研究和技術應用，以及癌癥調控機制等方面的發展。

發明內容

???????本發明的目的之一在于提供一種miR-290家族在促進小鼠胚胎干細胞增殖中的應用。

本發明的目的之二在于提供一種miR-290家族在促進小鼠胚胎干細胞G1/S轉化中的應用。

本發明的目的之三在于提供一種miR-290家族在調控小鼠胚胎干細胞細胞周期和自我更新能力維持中的應用。

本發明通過qRT-PCR手段，在不同多功能分化潛能的細胞系（CGR8>P19>N₂A）中，檢測miR-290家族的表達量變化。發現，miR-290家族在mESCCGR8中的表達量最高，在多能性細胞P19中次之，而在已分化的神經母細胞N₂A中沒有表達。該結果說明miR-290家族的表達量與細胞的多功能性成正相關性。

將miR-290家族過表達或下調后，檢測CGR8、P19、N₂A細胞增殖和細胞周期的變化。在N₂A細胞中轉染miR-290家族的mimics，通過CCK8和流式細胞周期分析手段發現，miR-290家族促進N₂A的細胞增殖，并加快G1/S轉化。此外，在另兩株miR-290家族高表達的細胞系中轉染miR-290家族的inhibitor，通過同樣的實驗方法發現，miR-290的inhibitor能夠抑制細胞增殖并增加G1阻滯。上述結果說明在小鼠胚胎干細胞中miR-290家族能促進細胞增殖和細胞周期，有助于胚胎干細胞自我更新和分化潛能維持。

通過TargetScan預測，Ccnd1的3′-UTR中有miR-290家族種子序列的結合位點。將Ccnd1野生型3′-UTR以及含有種子序列突變的3′-UTR構建到pGL-3報告基因的下游，通過雙熒光素酶報告分析，發現帶有Ccnd1野生型3′-UTR報告基因受到miR-290家族調控，而突變型不受miR-290家族調節。此外，在N₂A和?P19細胞分別過表達和抑制miR-290家族，western?blotting結果證明Ccnd1受到miR-290家族下調。上述結果證實，Ccnd1是miR-290家族的靶基因。