[發(fā)明專利]雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗的制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310172285.2
• 申請(qǐng)日: 2013-05-10
• 公開（公告）號(hào): CN103212068A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙凱
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 黑龍江大學(xué)
• 主分類號(hào): A61K39/215
• 分類號(hào): A61K39/215;A61K47/36;A61P31/14
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標(biāo)事務(wù)所 23109
• 代理人: 金永煥

1.雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗的制備方法，其特征在于雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗的制備方法按以下的實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)現(xiàn)：

一、取50～400μl?IBV?H120系病毒液加入無(wú)菌去離子水補(bǔ)足至2mL，然后加入到5mL濃度為0.5～2.0mg/mL的過(guò)濾除菌后的N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖溶液中，然后在室溫、無(wú)菌條件下以攪拌速度為300r/min的條件下攪拌5min，得到混合溶液A；

二、將混合溶液A在室溫、無(wú)菌條件下以900r/min～1300r/min速度攪拌1min后，然后滴加2mL濃度為0.75～1.75mg/mL的過(guò)濾除菌后的N，O-羧甲基殼聚糖溶液；然后在攪拌速度不變的條件下磁力攪拌20min～50min，得到混合溶液B；

三、將混合溶液B于4℃、12000r/min離心20min，去上清，并用溫度為4℃的無(wú)菌去離子水洗滌沉淀3遍，收集固相物；

四、將固相物加入到4℃的無(wú)菌去離子水中，再加入質(zhì)量濃度為5％的蔗糖脫脂乳溶液，真空冷凍干燥24h，得到雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗，即完成雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗的制備方法；其中步驟一中IBV?H120系病毒液為經(jīng)過(guò)濃縮純化后的雞傳染性支氣管炎H120系病毒液，病毒含量為10^6.5EID₅₀/0.1mL；步驟四中4℃的無(wú)菌去離子水與質(zhì)量濃度為5％的蔗糖脫脂乳溶液的體積比為1∶1。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗，其特征在于步驟一和步驟二所述的過(guò)濾除菌的方法為：在無(wú)菌操作臺(tái)中通過(guò)0.22μm的細(xì)菌濾器進(jìn)行過(guò)濾。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗，其特征在于步驟一中所述的取200μl病毒液并加入無(wú)菌去離子水補(bǔ)足至2mL，然后加入到5mL濃度為1.0mg/mL的過(guò)濾除菌后的N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖溶液中。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗，其特征在于步驟二中所述的將混合溶液A在室溫、無(wú)菌條件下以1200r/min攪拌1min后，然后滴加2mL濃度為0.8mg/mL的過(guò)濾除菌后的N，O-羧甲基殼聚糖溶液。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗，其特征在于步驟二中所述的N，O-羧甲基殼聚糖的合成方法按以下步驟實(shí)現(xiàn)：

一、將5g粉末狀殼聚糖置于250mL三口燒瓶中，加入40mL異丙醇并攪拌，浸泡1-12h后加入60mL濃度為10-40mol/L的NaOH溶液，攪勻后浸泡2～24h，得堿化殼聚糖；

二、將20g氯乙酸水浴加熱溶于10mL的異丙醇中，然后均勻分成五份，再依次在攪拌狀態(tài)下加入到堿化殼聚糖中，每份間隔10min加入，然后在40～80℃下反應(yīng)2～8h，制得羧甲基殼聚糖混合物，然后加入20mL蒸餾水，用體積濃度為1％的鹽酸調(diào)pH至7.0，再用布氏漏斗抽濾，濾液中加入4倍量的無(wú)水乙醇充分沉淀，過(guò)濾，然后依次用體積濃度為95％的乙醇和無(wú)水乙醇洗滌，再置于30～60℃下真空干燥6～24h，得精制品，即完成N，O-羧甲基殼聚糖的合成。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗，其特征在于步驟二中所述的磁力攪拌時(shí)間是40min。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗，其特征在于步驟二中所述的過(guò)濾除菌后的N，O-羧甲基殼聚糖的滴加速度為0.007mL/s。