[發(fā)明專(zhuān)利]一種啟動(dòng)子及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310170810.7
• 申請(qǐng)日: 2013-05-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103243099A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-08-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄧學(xué)梅;楊祖;崔凱
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/113
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/113;C12N15/63;C12N1/21;C12N1/19;C12N1/15;C12N5/10
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種啟動(dòng)子及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

當(dāng)今毛紡織品朝著輕薄、柔軟的高檔次方向發(fā)展，使得毛紡織工業(yè)對(duì)細(xì)毛羊的綜合品質(zhì)要求越來(lái)越高。近20多年來(lái)，澳洲羊毛細(xì)度發(fā)生了很大變化，目前有1/3以上的羊毛屬于超細(xì)羊毛，且這一趨勢(shì)還在繼續(xù)發(fā)展中。為適應(yīng)市場(chǎng)需求，我國(guó)從20世紀(jì)80年代開(kāi)始對(duì)中國(guó)美利奴超細(xì)毛羊進(jìn)行選育。但至今我國(guó)培育的超細(xì)毛羊毛細(xì)度尚達(dá)不到國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，且在產(chǎn)量上尚不能批次生產(chǎn)，供求缺口很大。

在培育轉(zhuǎn)基因超細(xì)毛美利奴綿羊的研究中，急需獲得皮膚毛囊組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子指導(dǎo)目標(biāo)基因表達(dá)，從而分析和評(píng)價(jià)不同目標(biāo)基因?qū)γ疑L(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制。此基礎(chǔ)研究工作，為培育優(yōu)良超細(xì)毛美利奴綿羊品種、增加羊毛產(chǎn)量、改善羊毛品質(zhì)提供了科學(xué)依據(jù)。

HGTP（高甘氨酸-酪氨酸蛋白），屬于KAP（角蛋白相關(guān)蛋白）家族的重要成員之一，相對(duì)富含甘氨酸-酪氨酸（35%～60%）。根據(jù)氨基酸殘基和溶解性分為I型（KAP7和KAP8，氨基酸含量為50%）和II型（KAP6亞家族，氨基酸含量77%）。KAP6.1基因?qū)儆贙AP6亞家族中的一員。HGTP在毛囊的表達(dá)具有嚴(yán)格的時(shí)空表達(dá)特異性，但是在不同物種間存在差異。美利奴綿羊毛囊組織的原位雜交實(shí)驗(yàn)表明，綿羊KAP6基因表達(dá)僅限于毛囊球增殖區(qū)域上部約200μm處，該層為正在分化的毛干角質(zhì)化細(xì)胞，且發(fā)現(xiàn)KAP6.1基因僅在毛囊正皮質(zhì)區(qū)表達(dá)，KAP6.1基因表達(dá)的這種高度特異性和不對(duì)稱(chēng)性說(shuō)明其在毛囊正副皮質(zhì)細(xì)胞中的比例和分布對(duì)羊毛的彎曲有重要作用。通過(guò)對(duì)美利奴羊突變個(gè)體研究表明，突變后羊毛纖維變粗、彎曲減少，KAP6.1基因、KAP7基因和KAP8基因表達(dá)嚴(yán)重下調(diào)，且在突變體毛囊細(xì)胞中只有副皮質(zhì)細(xì)胞，這說(shuō)明KAP6.1和KAP8直接影響了羊毛的細(xì)度和彎曲。

KAP6.1基因表達(dá)的時(shí)空特異性是由其5’側(cè)翼區(qū)的基序調(diào)控的，關(guān)于該基因的序列報(bào)道，包括編碼區(qū)和5’側(cè)翼區(qū)1042bp的序列，如序列表的序列1自5’末端第488至1529位核苷酸所示。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種啟動(dòng)子及其應(yīng)用。

本發(fā)明提供的啟動(dòng)子，獲自敖漢細(xì)毛羊，為如下1）或2）或3）所述的DNA分子：

1）序列表的序列1所示的DNA分子；

2）在嚴(yán)格條件下與1）限定的DNA序列雜交且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子；

3）與1）限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子。

所述嚴(yán)格條件為在0.1×SSPE（或0.1×SSC）、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。

含有所述啟動(dòng)子的表達(dá)盒、重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述重組載體可為重組質(zhì)粒，具體可為將所述啟動(dòng)子導(dǎo)入pGL3-Basic載體得到的重組質(zhì)粒。

本發(fā)明還保護(hù)所述DNA分子作為啟動(dòng)子的應(yīng)用。

本發(fā)明還保護(hù)所述DNA分子在啟動(dòng)目的基因表達(dá)中的應(yīng)用。用所述DNA分子啟動(dòng)目的基因表達(dá)的實(shí)現(xiàn)方法具體可為：將自上游至下游依次包括所述DNA分子和所述目的基因的表達(dá)盒導(dǎo)入表達(dá)載體，得到重組表達(dá)載體，然后將所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞并培養(yǎng)宿主細(xì)胞。所述目的基因可為促進(jìn)羊毛生長(zhǎng)、改善羊毛品質(zhì)的相關(guān)功能基因。所述目的基因可為編碼螢火蟲(chóng)熒光素酶的基因。所述重組表達(dá)載體可為將所述啟動(dòng)子導(dǎo)入pGL3-Basic載體得到的重組質(zhì)粒。所述宿主細(xì)胞可為綿羊皮膚組織原代細(xì)胞。

本發(fā)明公開(kāi)了一種啟動(dòng)子，與現(xiàn)有啟動(dòng)子相比具有更高的啟動(dòng)目的基因表達(dá)的活性，可以滿(mǎn)足目的基因在綿羊皮膚組織中的表達(dá)要求，滿(mǎn)足目的基因在毛囊組織中高效特異性表達(dá)的要求。本發(fā)明不僅能用于毛發(fā)細(xì)度、彎曲和毛囊發(fā)育中基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究，而且對(duì)轉(zhuǎn)基因超細(xì)毛美利奴綿羊的培育也起到了促進(jìn)作用。

附圖說(shuō)明

圖1為重組質(zhì)粒甲構(gòu)建過(guò)程中的瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖2為重組質(zhì)粒乙構(gòu)建過(guò)程中的瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖3為各組處理后，細(xì)胞的螢火蟲(chóng)熒光素酶的相對(duì)活性結(jié)果。

具體實(shí)施方式