[發(fā)明專利]產(chǎn)豐加霉素的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌工程菌、構(gòu)建方法及用途

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310170658.2
• 申請日: 2013-05-08
• 公開（公告）號: CN103243062A
• 公開（公告）日: 2013-08-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馬正;俞曉平;劉金秀;申屠旭萍;邊亞琳;郝培應(yīng);許益鵬
• 申請（專利權(quán)）人: 中國計量學院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/31;C12N15/76;C12P19/40;C12R1/525
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 張法高

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及利用透明顫菌血紅蛋白基因在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌中表達提高豐加霉素產(chǎn)量的方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

　　豐加霉素是一種新型核苷類抗生素，分子式為C₁₂H₁₃N₅O₄，核糖C₁連接類似鳥嘌呤的脫氮雜嘌呤環(huán)，核心結(jié)構(gòu)為吡咯嘧啶核苷類似物。作用機理主要是通過抑制微生物的轉(zhuǎn)錄而影響菌體的生長，其生物活性研究報道主要集中在臨床醫(yī)學領(lǐng)域。近期有研究發(fā)現(xiàn)豐加霉素對多種植物疫病具有良好的防治效果，長期使用不會造成環(huán)境污染，而且對植物生長也具有一定的調(diào)節(jié)作用。因此，豐加霉素在農(nóng)業(yè)植物病害防治領(lǐng)域具有的應(yīng)用潛力。相對于化學合成法，生物法合成豐加霉素以可再生資源為原料，具有反應(yīng)條件溫和、污染少以及成本低廉等優(yōu)點，因此，生物合成法是目前豐加霉素工業(yè)化生產(chǎn)比較經(jīng)濟有效的方法。

?　　豐加霉素屬于次級代謝產(chǎn)物，在發(fā)酵過程中菌絲結(jié)構(gòu)稠密，發(fā)酵液粘稠導致溶氧水平受到限制，導致豐加霉素合成水平較低，生產(chǎn)能耗較大，難以規(guī)模化生產(chǎn)。解決該問題的現(xiàn)有方法一般都局限于通過通入純氧、通氣/攪拌優(yōu)化配置等方式來提高細胞生長環(huán)境中的氧氣傳遞性質(zhì)，增加了生產(chǎn)成本。

透明顫菌血紅蛋白（VHb）是目前為止研究最為透徹的原核生物血紅蛋白，許多研究均表明它在細胞中處于限氧條件下促進細胞生長、提高細胞培養(yǎng)密度和蛋白質(zhì)合成能力。抗生素的生產(chǎn)是一個好氧的過程，由于VHb在微氧條件下可以提高細胞的溶氧水平，促進細胞的生長以及提高次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，因此VHb在抗生素生產(chǎn)中受到廣泛的研究和應(yīng)用。安德榮等SOE-PCR?(Splicing?by?overlap?extension?PCR)技術(shù)構(gòu)建含紅霉素抗性基因啟動子PermE?和?vgb?結(jié)構(gòu)基因融合片段的整合型表達載體?pJD100，利用接合轉(zhuǎn)移法將vgb基因整合到瑞拉菌素產(chǎn)生菌委內(nèi)瑞拉鏈霉菌秦嶺變種中，使工程菌株的效價提高，但其中獲得基因融合片段的過程操作復(fù)雜，易產(chǎn)生移碼突變。陳文青等基于質(zhì)粒pWQ2005中的硫鏈絲菌素誘導啟動子PtipA啟動vgb的表達，利用接合轉(zhuǎn)移法將vgb基因整合到泰樂菌素的生產(chǎn)菌株弗氏鏈霉菌中，但由于PtipA啟動子受到硫鏈絲菌素誘導，發(fā)酵過程中添加對菌體生長不利。載體pIB139是在鏈霉菌整合型質(zhì)粒pSET152的多克隆位點加入啟動子PermE*構(gòu)建而成的鏈霉菌穿梭質(zhì)粒，便于基因在鏈霉菌中的高效表達，同時由于其中具有用于接合轉(zhuǎn)移的oriT功能區(qū)域，鏈霉菌篩選標記-安普抗性基因（apr），整合酶基因，鏈霉菌溫和噬菌體ΦC31的attP位點。因此，pIB139可利用簡便高效的屬間接合轉(zhuǎn)移法導入鏈霉菌，并可通過特異性重組整合在鏈霉菌染色體的attB位點上，隨著宿主染色體的復(fù)制而復(fù)制并賦予安普抗性。趙廣榮等將vgb基因置于pIB139中的PermE*下游，通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化將其轉(zhuǎn)入鏈霉菌中。但是其中原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化操作復(fù)雜，需要原生質(zhì)體的制備，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化還存在宿主的限制性修飾系統(tǒng)而導致轉(zhuǎn)化效率較低，同時趙廣榮等并未考察重組菌中vgb表達對菌株合成目的代謝產(chǎn)物的影響。

發(fā)明內(nèi)容

??　　為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)豐加霉素的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌工程菌、構(gòu)建方法及用途。

?　　淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces?diastatochromogenes)?1628是一株拮抗放線菌，其發(fā)酵液對多種植物病原真菌具有較強的抑制作用，經(jīng)分離提取，確定其主要有效成分為豐加霉素，尚未見淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的遺傳表達體系的研究報道。本發(fā)明以綠色熒光蛋白基因(gfp)作為報告基因，成功構(gòu)建了含有permE^*啟動子的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌重組表達載體pIB139-gfp，對其在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌中啟動子活性進行研究后發(fā)現(xiàn)，在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌中permE^*啟動子可有效啟動外源基因的表達。在此基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建了攜帶有來源于透明顫菌血紅蛋白基因vgb的表達質(zhì)粒pIB139-vgb，并通過接合轉(zhuǎn)移法將其整合在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628染色體上。