[發(fā)明專利]一種莖瘤芥來源的鈣離子結合蛋白及其編碼基因與應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310168965.7
• 申請日: 2013-05-06
• 公開（公告）號: CN103243108A
• 公開（公告）日: 2013-08-14
• 發(fā)明（設計）人: 向瀏欣;蔡應繁;劉吉軍;王小艷;付于銀
• 申請（專利權）人: 重慶郵電大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/415;C12N15/70;C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產(chǎn)權代理有限公司 11129
• 代理人: 謝殿武

技術領域

本發(fā)明涉及基因工程領域，具體涉及莖瘤芥來源的鈣離子結合蛋白及其編碼基因與應用。

背景技術

鈣離子信號在許多細胞活動，如細胞代謝、基因表達、細胞骨架動態(tài)變化、細胞周期、細胞死亡、信號傳導等過程中有重要作用。

在植物細胞中，鈣離子的作用之一是作為第二信使，很多外界環(huán)境信號，如光、生物脅迫、非生物脅迫、植物激素等都會刺激胞液中Ca²⁺濃度的增加，從而引發(fā)鈣離子信號傳導。鈣離子信號傳導途徑中首先響應的即是鈣離子結合蛋白，其結合Ca²⁺以后會發(fā)生構想變化，使疏水面外露，從而激活或抑制其它蛋白的活性，從而引發(fā)信號傳導。

高鹽、干旱和低溫等非生物脅迫環(huán)境對作物的產(chǎn)量及生長發(fā)育有很大影響，因此，有關植物抗逆性基因的研究一直是植物學研究領域的熱點之一。

莖瘤芥（Brassica?juncea?var.tumida?Tsen?et?Lee），又稱青菜頭，是十字花科蕓薹屬植物，為榨菜的主要原料，是我國重慶、四川、浙江等地區(qū)主要的經(jīng)濟作物之一。多年來，莖瘤芥的相關研究主要集中在遺傳育種、良種繁育、栽培技術、品質安全等領域，近年才陸續(xù)有生物學方面研究的報道，包括基因的克隆、功能研究以及莖瘤芥瘤狀莖膨大相關研究，企圖通過基因工程方法提高莖瘤芥的產(chǎn)量、質量以及抗病性、抗逆性等。

對于莖瘤芥，目前還未見其鈣離子結合蛋白的序列以及基因功能的報道，本發(fā)明克隆了第一個莖瘤芥鈣離子結合蛋白，且經(jīng)大量實驗研究表明，該蛋白具有提高植物抗逆性的作用，為植物抗逆性基因的研究和應用提供了新內容和新基礎。

發(fā)明內容

鑒于此，本發(fā)明的目的之一是提供莖瘤芥（英文：Brassica?juncea?var.tumida?Tsen?et?Lee）來源的鈣離子結合蛋白（英文：calcium-binding?protein）基因，將其命名為BjCBP1，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1所示，該基因長627bp。

本發(fā)明的目的之二是提供莖瘤芥來源的鈣離子結合蛋白BjCBP1，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO.3所示，有208個氨基酸，且序列通過NCBI的保守結構域（conserved?domains）檢測知具有4個EFh結構域。

本發(fā)明的目的之三是提供莖瘤芥鈣離子結合蛋白基因BjCBP1的重組原核表達載體pET32a-BjCBP1，其由SEQ?ID?NO.1序列與原核表達載體pET-32a(+)構成。

本發(fā)明的目的之四是提供莖瘤芥鈣離子結合蛋白基因BjCBP1的重組植物表達載體pCAMBIA1302-BjCBP1，其由SEQ?ID?NO.1序列與植物表達載體pCAMBIA1302構成。

本發(fā)明的目的之五是提供莖瘤芥鈣離子結合蛋白基因BjCBP1在提高植物耐逆境特性的應用，尤其是提高植物在高鹽條件的耐受力。

本發(fā)明通過莖瘤芥轉錄組測序獲得序列片段SEQ?ID?NO.4，然后根據(jù)片段SEQ?ID?NO.4設計巢式引物并通過RACE方法擴增獲得莖瘤芥第一個鈣離子結合蛋白基因BjCBP1，基因編碼208個氨基酸，NCBI比對預測具有4個EF-hand結構域，屬于鈣離子結合蛋白家族成員；通過構建BjCBP1基因的原核表達載體進行原核表達和蛋白純化，發(fā)現(xiàn)BjCBP1能夠結合鈣離子，證明是鈣離子結合蛋白；通過構建BjCBP1基因植物表達載體，可直接用于農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化，創(chuàng)制耐逆境新種質，提高植物的逆境耐受力特性，尤其是耐鹽特性，可進行植物品種改良。

附圖說明

圖1為本發(fā)明BjCBP1基因編碼區(qū)序列PCR擴增的瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖2為本發(fā)明原核表達純化后的BjCBP1蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳圖；

圖3為本發(fā)明重組植物表達載體pCAMBIA1302-BjCBP1的構建流程圖；

圖4為本發(fā)明轉基因型擬南芥和野生型的BjCBP1基因表達水平檢測圖；

圖5為本發(fā)明NaCl、Mannitol和ABA條件下野生型與轉基因型擬南芥種子發(fā)芽率結果圖；

圖6為本發(fā)明NaCl、Mannitol和ABA條件下野生型與轉基因型擬南芥的生長情況攝影圖；

圖7為本發(fā)明NaCl和ABA條件下野生型與轉基因型擬南芥的抗逆基因的表達水平檢測結果圖

圖8為本發(fā)明NaCl下野生型與轉基因型擬南芥的存活率統(tǒng)計圖。

具體實施方式