[發(fā)明專利]齊墩果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制備方法及其用途

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310165693.5
• 申請(qǐng)日: 2013-05-08
• 公開（公告）號(hào): CN103233055A
• 公開（公告）日: 2013-08-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 余伯陽(yáng);杜晨暉;張劍;許少華;朱羽堯;錢利武
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)藥科大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P33/20
• 分類號(hào): C12P33/20;C07J63/00;A61K31/7024;A61P29/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物藥物領(lǐng)域，具體涉及齊墩果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制備方法，本發(fā)明還公開了其抗炎方面的用途。

背景技術(shù)

炎癥是人類疾病中最常見的一種病理過程，與大多數(shù)疾病相關(guān)。抗炎藥物是臨床上僅次于抗感染藥物的第二大類藥物，目前臨床上應(yīng)用較多的抗炎藥物主要是非甾體抗炎藥和腎上腺皮質(zhì)激素類藥物，但是這些藥物作用是多靶點(diǎn)，多途徑的，使用的劑量和療程也各有不同而且各種機(jī)制之間也存在復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，長(zhǎng)期使用會(huì)帶來很多不良反應(yīng)。隨著對(duì)中藥的不斷地開發(fā)和認(rèn)識(shí)以及多年的臨床和實(shí)驗(yàn)證實(shí)，很多中藥具有良好的抗炎作用，毒副作用小而且資源豐富，因此中藥單體的開發(fā)和結(jié)構(gòu)改造以及對(duì)其藥理作用機(jī)制的研究已經(jīng)成為當(dāng)今世界上新藥開發(fā)的熱點(diǎn)。五環(huán)三萜類化合物廣泛分布于各種植物中，具有廣泛的生物活性，研究顯示在抗炎方面具有顯著的活性。如齊墩果酸具有明顯的抗炎作用，但水溶性差，可能影響了其藥效的發(fā)揮。為了增加水溶性，同時(shí)保持或者提高其活性，對(duì)它進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，化學(xué)合成了大量的衍生物，其中不乏有活性好的化合物發(fā)現(xiàn)。但有關(guān)齊墩果酸的微生物糖基化修飾少見于報(bào)道。

微生物轉(zhuǎn)化是利用微生物產(chǎn)生的特異酶對(duì)外源性化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的特定生化反應(yīng)。微生物轉(zhuǎn)化具有高度的立體結(jié)構(gòu)選擇性，能專一地催化特定的反應(yīng)、無需繁瑣的保護(hù)與脫保護(hù)操作，具有高效、環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)，是天然活性化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的一種有效方法。若在含有羧基的齊墩果烷型五環(huán)三萜苷元類化合物中引入糖基可以在一定程度上解決生物利用度差的問題，同時(shí)保持其活性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明公開了結(jié)構(gòu)式I的化合物：

命名為齊墩果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。本發(fā)明同時(shí)也包括結(jié)構(gòu)式I的化合物的溶劑化物。

表1齊墩果酸與齊墩果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷¹³C-NMR數(shù)據(jù)如下：

藥理試驗(yàn)證明，本發(fā)明的式I化合物具有明顯的的抗炎活性，其溶劑化物具有同樣的藥理功效。

本發(fā)明的式I化合物優(yōu)選用生物轉(zhuǎn)化方法以齊墩果酸為底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化制備，方法如下：

為了尋找適宜轉(zhuǎn)化齊墩果酸成齊墩果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的菌種，本發(fā)明共篩選了多個(gè)菌種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，保藏號(hào)為NRRL1086菌種對(duì)齊墩果酸具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)化能力(見表2)。

篩選所用液體培養(yǎng)基(PDA)：200克新鮮去皮馬鈴薯加沸水500mL煮15min后過濾，濾液加葡萄糖20g、KH₂PO₄3.0g、MgSO₄0.75g、Vb₁10.0mg，加蒸餾水定容至1.0L，加NaOH或HCL調(diào)pH值至6.0，150mL三角燒瓶每瓶分裝30mL液體培養(yǎng)基，121℃、0.15MPa滅菌20min。

篩選菌種時(shí)，保存菌種所用斜面培養(yǎng)基是在上述液體培養(yǎng)基加入1.5％的瓊脂，15mL具塞試管每管5mL，121℃、0.15MPa滅菌20min冷卻后制成。

菌種的保存與活化：菌種活化采用兩步活化法，參見：Nair，M.S.R.，and?Basile，D.V.Bioconversion?ofartenium?B?to?artmisinn.天然產(chǎn)物雜志(Jounal?ofNatural?Products)1993，56(9)：1559。先將菌種接種于液體培養(yǎng)基，28℃180r/min旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)24-48h后，轉(zhuǎn)接于另一液體培養(yǎng)基，接種量1-5％(V/V)，同條件培養(yǎng)24h后加樣。

樣品的制備及加樣：齊墩果酸溶于乙醇，配成10mg/mL溶液備用；每瓶經(jīng)兩步活化的菌液(30mL)加0.5mL樣品溶液，使每瓶菌液含齊墩果酸5mg。同條件培養(yǎng)120h后，中止反應(yīng)，過濾菌體，發(fā)酵液用等量的乙酸乙酯萃取3～5次，合并萃取液、回收乙酸乙酯；得到萃取浸膏，菌體用乙醇提取3次，合并提取液，回收乙醇，得到提取浸膏，將兩種浸膏合并，加少許乙酸乙酯溶解后備薄層鑒定用。

空白對(duì)照：空白對(duì)照設(shè)陽(yáng)性對(duì)照(底物+培養(yǎng)基)、陰性對(duì)照(培養(yǎng)基+菌)、溶劑對(duì)照(培養(yǎng)基+菌+乙醇)，培養(yǎng)和萃取條件同上。

轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的薄層鑒定：

薄層條件：

薄層板：0.7％的CMC-Na制成的硅膠G板。

展開劑：甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(14∶4∶0.5)。

顯色劑：10％硫酸乙醇

操作：