[發(fā)明專利]白樺脂酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制備方法及其用途

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310165683.1
• 申請日: 2013-05-08
• 公開（公告）號: CN103215336A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 余伯陽;杜晨暉;張劍;許少華;朱羽堯;錢利武
• 申請（專利權(quán)）人: 中國藥科大學(xué)
• 主分類號: C12P33/20
• 分類號: C12P33/20;A61K31/7024;A61P29/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物藥物領(lǐng)域，具體涉及白樺脂酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制備方法，本發(fā)明還公開了其抗炎方面的用途。

背景技術(shù)

炎癥是人類疾病中最常見的一種病理過程，與大多數(shù)疾病相關(guān)。抗炎藥物是臨床上僅次于抗感染藥物的第二大類藥物，目前臨床上應(yīng)用較多的抗炎藥物主要是非甾體抗炎藥和腎上腺皮質(zhì)激素類藥物，但是這些藥物作用是多靶點，多途徑的，使用的劑量和療程也各有不同而且各種機(jī)制之間也存在復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，長期使用會帶來很多不良反應(yīng)。隨著對中藥的不斷地開發(fā)和認(rèn)識以及多年的臨床和實驗證實，很多中藥具有良好的抗炎作用，毒副作用小而且資源豐富，因此中藥單體的開發(fā)和結(jié)構(gòu)改造以及對其藥理作用機(jī)制的研究已經(jīng)成為當(dāng)今世界上新藥開發(fā)的熱點。五環(huán)三萜類化合物廣泛分布于各種植物中，具有廣泛的生物活性，研究顯示在抗炎方面具有顯著的活性。如白樺脂酸具有明顯的抗炎作用，但水溶性差，影響了其藥效的發(fā)揮。為了增加水溶性，同時保持其活性，對它進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，化學(xué)合成了大量的衍生物，其中不乏有活性好的化合物發(fā)現(xiàn)。但有關(guān)白樺脂酸的微生物糖基化修飾少見于報道。

微生物轉(zhuǎn)化是利用微生物產(chǎn)生的特異酶對外源性化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的特定生化反應(yīng)。微生物轉(zhuǎn)化具有高度的立體結(jié)構(gòu)選擇性，能專一地催化特定的反應(yīng)、無需繁瑣的保護(hù)與脫保護(hù)操作，具有高效、環(huán)保的優(yōu)點，是天然活性化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的一種有效方法。若在含有羧基的羽扇豆烷型五環(huán)三萜類苷元中引入糖基可以在一定程度上解決生物利用度差的問題，同時保持其活性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明公開了結(jié)構(gòu)式I的化合物：

命名為白樺脂酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。本發(fā)明同時也包括結(jié)構(gòu)式I的化合物的溶劑化物。

表1白樺脂酸與白樺脂酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷¹³C-NMR數(shù)據(jù)如下：

藥理試驗證明，本發(fā)明的式I化合物具有優(yōu)異的抗炎活性。

本發(fā)明的式I化合物優(yōu)選用生物轉(zhuǎn)化方法以白樺脂酸為底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化制備，方法如下：

為了尋找適宜轉(zhuǎn)化白樺脂酸成白樺脂酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的菌種，本發(fā)明共篩選了多個菌種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，保藏號為NRRL1086菌種對白樺脂酸具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)化能力(見表2)。

篩選所用液體培養(yǎng)基(PDA)：200克新鮮去皮馬鈴薯加沸水500mL煮15min后過濾，濾液加葡萄糖20g、KH₂PO₄3.0g、MgSO₄0.75g、Vb₁10.0mg，加蒸餾水定容至1.0L，加NaOH或HCl調(diào)pH值至6.0，150mL三角燒瓶每瓶分裝30mL液體培養(yǎng)基，121℃、0.15MPa滅菌20min。

篩選菌種時，保存菌種所用斜面培養(yǎng)基是在上述液體培養(yǎng)基加入1.5％的瓊脂，15mL具塞試管每管5mL，121℃、0.15MPa滅菌20min冷卻后制成。

菌種的保存與活化：菌種活化采用兩步活化法，參見：Nair，M.S.R.，and?Basile，D.V.Bioconversion?ofartenium?B?to?artmisinn.天然產(chǎn)物雜志(Jounal?ofNatural?Products)1993，56(9)：1559。先將菌種接種于液體培養(yǎng)基，28℃180r/min旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)24-48h后，轉(zhuǎn)接于另一液體培養(yǎng)基，接種量1-5％(V/V)，同條件培養(yǎng)24h后加樣。

樣品的制備及加樣：白樺脂酸溶于乙醇，配成10mg/mL溶液備用；每瓶經(jīng)兩步活化的菌液(30mL)加0.5mL樣品溶液，使每瓶菌液含白樺脂酸5mg。同條件培養(yǎng)120h后，中止反應(yīng)，過濾菌體，發(fā)酵液用等量的乙酸乙酯萃取3～5次，合并萃取液、回收乙酸乙酯；得到萃取浸膏，菌體用乙醇提取3次，合并提取液，回收乙醇，得到提取浸膏，將兩種浸膏合并，加少許乙酸乙酯溶解后備薄層鑒定用。

空白對照：空白對照設(shè)陽性對照(底物+培養(yǎng)基)、陰性對照(培養(yǎng)基+菌)、溶劑對照(培養(yǎng)基+菌+乙醇)，培養(yǎng)和萃取條件同上。

轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的薄層鑒定：

薄層條件：

薄層板：0.7％的CMC-Na制成的硅膠G板。

展開劑：甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(14∶4∶0.5)。

顯色劑：10％硫酸乙醇

操作：