[發明專利]一種抗人CRT 單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區

有效

• 申請號: 201310163559.1
• 申請日: 2013-05-07
• 公開（公告）號: CN103265631A
• 公開（公告）日: 2013-08-28
• 發明（設計）人: 陳麗華;劉蓉蓉;龔玖瑜;金伯泉;宋朝君
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C12N15/11;A61K39/395
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 汪人和

技術領域

本發明屬于抗腫瘤技術領域，涉及一種抗人CRT單克隆抗體，特別涉及一種抗人CRT單克隆抗體（FMMU-CRT-10）的重鏈和輕鏈可變區。?

背景技術

惡性腫瘤是危害人類健康的重大疾病，針對其的治療手段目前仍處于研究和探索階段。繼傳統的手術治療、放療、化療和免疫治療之后，以結合基因工程和蛋白質工程技術為代表的靶向抗體藥物治療正成為治療腫瘤的新興研究領域，受到基礎醫學和臨床醫學研究領域科研工作者的廣泛關注。?

CRT（鈣網蛋白）是一種分子量為46kDa的內質網分子伴侶，它不僅存在于內質網中，還分布于細胞胞質區、胞膜表面以及細胞外基質等非內質網結構中，作為一個重要的調節分子參與機體傷口愈合、免疫反應、組織纖維化和腫瘤的發生、發展等生理和病理過程。CRT在白血病、非霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、腦癌、卵巢癌、胃癌、肝癌和肺癌等多種腫瘤細胞中廣泛表達，且與腫瘤的侵襲性呈正相關（CRT表達水平越高，腫瘤的侵襲性越高）。作為一個促吞噬的信號，CRT可與吞噬細胞表面的受體低密度脂蛋白（LRP）相結合，促使靶細胞被吞噬。CRT能有效地提呈抗原，與抗原肽結合形成抗原提呈復合物。?

有關CRT的抗腫瘤免疫研究表明，pcDNA3-CRT/E7真核表達質粒聯合咪喹莫特治療TC-1腫瘤鼠，可以有效地增強藥物的抗腫瘤作用，并延長荷瘤小鼠的生存期；CRT疫苗可以有效地促進巨噬細胞和NK細胞的抗腫瘤作用。?

目前針對CRT的抗體，國內商品化CRT抗體只有多抗，沒有單抗。盡管國外公司有針對CRT分子的單抗，如Abcam公司的CRT單抗（貨號ab83200），但其只能用于流式細胞術(1:100稀釋)檢測。?

抗體單體分子是由兩條相同的重鏈（H鏈）和兩條相同的輕鏈（L鏈），通過鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。H鏈和L鏈包括氨基端（N）和羧基端（C），靠近N端的可變區（V區）由高變區/互補決定區（HVR/CDR）和骨架區（FR）組成；靠近C端為恒定區（C區）。重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL）形成的蛋白質折疊是抗原結合部位，其中的CDR/HVR是抗體與抗原決定基互補結合的部位，C區引發抗原抗體識別后的反應。抗體根據FR/C區不同可分為人源、鼠源等，鼠源性抗體在人體內使用時具有免疫原性，易引起人體的免疫反應，這些免疫反應可引起對鼠源性抗體的清除以及免疫復合物介導的超敏反應。為了克服鼠源性抗體的缺陷，需要構建高親和力的特異性的嵌合抗體、單鏈抗體或人源化抗體。?

在構建人源化抗體過程中，采用噬菌體抗體庫等技術獲得的人源化抗體在使用過程中常常會出現親和力不高、使用劑量大等問題。為獲得具有較高親和力的人源化抗體，常常需要改造具有良好特異性和親和力的鼠源性親本抗體。其常規策略為：克隆鼠源性抗體輕鏈和重鏈可變區基因，將可變區基因克隆入相應載體構建相應的基因工程抗體重組DNA，表達基因工程抗體來制備人源化抗體。因此，篩選出特異性分泌高親和力鼠源性單克隆抗體的雜交瘤細胞克隆，從中克隆出高親和力抗體的重鏈和輕鏈可變區基因，分析其核苷酸和氨基酸序列對進一步構建高親和力和特異性的人源化基因工程抗體具有決定性的意義。?

發明內容

本發明解決的問題在于提供一種抗人CRT單克隆抗體，包括其核苷酸和氨基酸序列，為構建高親和力的抗人CRT嵌合或人源化基因工程抗體提供支?持。?

本發明是通過以下技術方案來實現：?

一種抗人CRT單克隆抗體，包括重鏈和輕鏈，所述輕鏈的可變區的3個互補決定區（CDR）序列為：?

CDR1:Met-Thr-Cys-Ser-Ala-Arg-Ser-Ser-Val-Ile-Tyr；?

CDR2：Ser-Ile-Ser；?

CDR3:Gln-Gln-Trp-Ser-Ser-Ser-Pro-Pro-Arg-Arg；?

所述重鏈的可變區的3個互補決定區（CDR）序列為：?

CDR1:Gly-Tyr-Asn-Phe-Thr-Lys-Tyr-Gly；?

CDR2:Ile-Asn-Thr-Asn-Thr-Gly-Glu-Pro；?

CDR3:Thr-Arg-Leu-Gly-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp。?

所述的單克隆抗體輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1，重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。?