[發(fā)明專利]一種牛乳β-乳球蛋白定量檢測試劑盒及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310158383.0
• 申請日: 2013-04-28
• 公開（公告）號: CN103293317A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 任一平;賴世云;張京順
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省疾病預(yù)防控制中心
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;C12Q1/37
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

（一）技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種可測定乳或乳制品中熱變性和非變性的常量或微量的牛乳β-乳球蛋白定量檢測試劑盒及其應(yīng)用。

（二）背景技術(shù)

牛乳是FAO/WHO認(rèn)定的導(dǎo)致人類食物過敏的八大類食品之一，是導(dǎo)致兒童食物過敏的常見食物，它在兒童中的發(fā)病率為0.1～7.5%，嚴(yán)重危害嬰幼兒健康。而其中的牛乳β-乳球蛋白被認(rèn)為是主要的過敏原。

牛乳β-乳球蛋白（Bovineβ-lactglobulin，β-LG）是牛奶當(dāng)中蛋白質(zhì)的一種，約占鮮奶蛋白質(zhì)的7-12%。在細(xì)胞及動物實驗研究中發(fā)現(xiàn)，β-乳球蛋白的水解物或分子修飾物，具有降膽固醇與抗氧化等生理活性。前人研究發(fā)現(xiàn)牛乳β-乳球蛋白存在多種形式的遺傳變異體，其中最主要的為變異體A（β-LG?A）和B（β-LG?B），它們之間的區(qū)別在于氨基酸序列中第64和118處兩個氨基酸殘基的不同（A中的ASP₆₄和Val₁₁₈分別改變?yōu)锽中的Gly₆₄和Ala₁₁₈），而人乳則完全不含β-乳球蛋白。

牛乳β-乳球蛋白是由162個氨基酸殘基組成的結(jié)構(gòu)緊密的單體球蛋白，每個單體含有兩個二硫鍵Cys₆₆-Cys₁₆₀和Cys₁₀₆-Cys₁₉₉，還有一個Cys₁₂₁自由巰基。結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，遺傳變異體β-LG?A的平均分子量為18363Da，遺傳變異體β-LG?B的平均分子量為18277Da,牛乳β-乳球蛋白平均分子量為18320Da。由于原料質(zhì)量混雜、加工工藝不同等原因造成產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊，但又沒有用于監(jiān)測乳與乳制品中β-乳球蛋白（包括β-LG?A和β-LG?B）的準(zhǔn)確有效的定量檢測方法，其中主要原因是缺少用于準(zhǔn)確定量測定的方法和必要的實驗材料。

目前國內(nèi)外用于牛乳β-乳球蛋白的檢測方法仍以SDS-PAGE法為主，該法為半定量方法，不能進(jìn)行準(zhǔn)確定量，由于操作繁瑣無法在普通的實驗室進(jìn)行推廣；有人提出了應(yīng)用GPC-UV的檢測方法，由于凝膠色譜柱的分辨力低，紫外光檢測靈敏度低的原因，而不能用于復(fù)雜基質(zhì)或低含量的樣品檢測；Christoph?Czerwenka（2007）等人采用LC-MS聯(lián)用方法測定牛奶和乳制品中牛乳β-牛乳球蛋白的含量，在正離子電噴霧模式下，選用全掃描提取離子的方式，使用山羊奶和水牛奶的兩種β-乳球蛋白變異體作為內(nèi)標(biāo)物，前者在樣品處理前加入，避免樣品在處理過程中的損失，克服了回收率低、基質(zhì)干擾大等問題，后者在樣品處理后加入，更加準(zhǔn)確定量。但未對此進(jìn)行系統(tǒng)的方法學(xué)的驗證。任一平（2010）等建立了LC-ESI-MS測定嬰幼兒配方中的牛乳β-乳球蛋白的方法，樣品經(jīng)直接提取，根據(jù)蛋白在電噴霧離子化條件下會產(chǎn)生多電荷離子的原理，采用選擇離子掃描模式（SIR）進(jìn)行檢測，該方法只限于試樣中非變性的牛乳β-乳球蛋白的定量檢測，無法測定因熱處理而變性的牛乳β-乳球蛋白。經(jīng)查詢，至今為止還未發(fā)現(xiàn)應(yīng)用同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)肽稀釋法，結(jié)合RPLC-ESI-MS/MS同時測定乳與乳制品中熱變性和非變性牛乳β-乳球蛋白的定量方法。

（三）發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種應(yīng)用同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)肽稀釋法，結(jié)合RPLC-ESI-MS/MS測定乳與乳制品中熱變性和非變性牛乳β-乳球蛋白的試劑盒及其應(yīng)用。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種牛乳β-乳球蛋白定量檢測試劑盒，主要包括牛乳β-乳球蛋白特異肽、同位素標(biāo)記牛乳β-乳球蛋白特異肽和同位素標(biāo)記牛乳β-乳球蛋白內(nèi)標(biāo)物，所述牛乳β-乳球蛋白特異肽的氨基酸序列為：TPEVDDEALEK；所述同位素標(biāo)記牛乳β-乳球蛋白特異肽的氨基酸序列為：TPEV^*DDEAL^*EK，其中V^*和L^*為碳氮全同位素標(biāo)記的氨基酸；所述同位素標(biāo)記牛乳β-乳球蛋白內(nèi)標(biāo)物（圖1）的氨基酸序列為：CQCLVRTPEV^*DDEAAL^*EKFDKALKA，其中V^＊和L^＊為碳氮全同位素標(biāo)記的氨基酸。