[發明專利]制備細菌核酸指紋特征譜庫的方法

有效

• 申請號: 201310158363.3
• 申請日: 2013-05-02
• 公開（公告）號: CN103352257A
• 公開（公告）日: 2013-10-16
• 發明（設計）人: 張學記;馬慶偉;趙洪斌;張海燕;趙艷梅
• 申請（專利權）人: 向華
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/10;C12R1/01;C12R1/32
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1.制備細菌核酸指紋特征譜庫的方法，其特征在于，它至少包括如下步驟：

（1）PCR反應：使用針對細菌的PCR通用引物，分別擴增多個細菌的核酸模板，得到含擴增目標區域的PCR產物；

（2）SAP酶消化：用堿性磷酸酶（SAP酶）處理步驟（1）得到的PCR產物；

（3）轉錄和核酸酶切：使用特定的轉錄和內切酶，分別在一個反應體系中，對步驟（2）得到的各個細菌的消化產物進行轉錄和核酸酶切，獲得一系列長度不一、豐度不一的核酸片段；

（4）純化：使用樹脂處理步驟（3）得到的酶切產物；

（5）質譜儀檢測：將步驟（4）得到的純化產物上點在含有基質的靶片上，上質譜儀進行檢測，得到不同細菌的特征核酸指紋譜圖。

(6)將得到的各種細菌的核酸指紋特征圖譜，通過計算機軟件進行匯總和整理，得到所述的細菌核酸指紋特征圖譜庫。

2.權利要求1的方法，其中所述軟件是BioExplore軟件，其版權號為軟著登字第136879號、登記號2009SR10700。

3.根據權利要求1的方法，其中PCR反應所擴增的細菌核酸序列，包括但不限定于細菌16S?rDNA上一個區域；通用引物包括但不限于SEQ?ID?No：1和SEQ?ID?No：2所示序列；且用于核酸酶切的特定酶，包括但不限于RNaseA酶。

4.權利要求3的方法，其中細菌16S?rDNA區域選自SEQ?ID?NO:3所示的區域，或者與SEQ?ID?NO:3所示序列具有至少60%同源性的序列。在其中的優選實施方案中，優選該序列具有62%、65%、68%、70%、72%、75%、78%、80%、82%、85%、88%、89%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源性的序列。

5.權利要求1或2的方法，其中步驟5的純化包括在轉錄和酶切產物中加入超純水，混勻后，再加入樹脂，上下顛倒混勻15分鐘；所述質譜儀是MALDI?TOF?MS質譜儀。

6.權利要求1-3中任一項的方法，其中所述細菌包括如表1所列的836種細菌。

7.在上述任一方案中，其中所述細菌還包括布魯氏菌(Brucella)、結核分枝桿菌（Mycobacterium?tuberculosis），以及幽門螺桿菌（Helicobacter?pylori，Hp）。

8.利用權利要求6的方法所建立的細菌核酸指紋特征圖譜，用于細菌鑒定或分類的方法，包括：

（1）PCR反應：使用針對細菌的PCR通用引物，擴增待測細菌的核酸模板，得到含擴增目標區域的PCR產物；

（2）SAP酶消化：用堿性磷酸酶（SAP酶）處理步驟（1）得到的PCR產物；

（3）轉錄和核酸酶切：使用特定的轉錄和內切酶，在一個反應體系中，對步驟（2）得到的細菌的消化產物進行轉錄和核酸酶切，獲得一系列長度不一、豐度不一的核酸片段；

（4）純化：使用樹脂處理步驟（3）得到的酶切產物；

（5）質譜儀檢測：將步驟（4）得到的純化產物上點在含有基質的靶片上，上質譜儀進行檢測，得到該細菌的核酸指紋特征圖譜；

（6）將所得核酸指紋特征圖譜與細菌核酸指紋特征圖譜庫進行比較，從而判斷待測細菌的類別或種屬。

9.權利要求7的方法，其中步驟6通過BioExplore軟件進行比較檢測。

10.提供能用于細菌分類和鑒定、耐藥篩選用途的試劑盒，包括：

（1）用于擴增細菌16S?rDNA的通用引物對及其緩沖液；

（2）SAP酶及其緩沖液；

（3）RNAase及其緩沖液；

（4）用于純化酶切產物的樹脂；

（5）用于比對核酸指紋特征圖譜的分析軟件。

11.權利要求9的試劑盒，其中所述引物是SEQ?ID?NO:1-2，所述軟件是BioExplore軟件，其軟著登字為第136879號、登記號為2009SR10700。