[發明專利]三種姬松茸SSR分子標記、其制備方法及使用其鑒別姬松茸菌株的方法

無效

• 申請號: 201310157795.2
• 申請日: 2013-05-02
• 公開（公告）號: CN103215262A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發明（設計）人: 江枝和;陳堅;陳愛華;李志生;朱炳耀;李占偉;王義祥;雷錦桂;翁伯琦;肖淑霞;黃志龍
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院土壤肥料研究所;福建省農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 福州市鼓樓區鼎興專利代理事務所(普通合伙) 35217
• 代理人: 傅契克

技術領域

本發明涉及三種姬松茸SSR分子標記、其制備方法及使用其鑒別姬松茸菌株的方法。

背景技術

姬松茸拉丁學名Agaricus?blazei?Murrill，是一種珍稀食藥用菌，它在真菌分類學上屬于擔了菌門、傘菌目、蘑菇科、蘑菇屬，原產于美國、巴西等地，人工栽培始于日本。1992年，福建省農林科學院食用菌中心引進了該菌種，并在國內首次栽培成功（江枝和1993），而后推廣到全國各地。該菇不僅味道鮮美、營養豐富，而目具有降血壓和抗癌的食療功效(戴玉成和楊祝良2008；Dai?et?al.?2009?)。考慮到該菇的價值極高，自2001年起，我們利用Co⁶⁰輻射誘變篩選姬松茸突變株并獲得一些具有一定程度性狀改變的菌株(江枝和等2003；江枝和等2004；翁伯琦等2007)，并予推廣。

????微衛星(microsatellite)序列，又稱為簡單序列重復(simple?sequencerepeat，SSR)，是以少數幾個核苷酸(一般2～4個)為重復單位的串聯重復DNA序列。它均勻、隨機、廣泛地分布于真核生物基因組中，且同種生物中微衛星序列的兩側順序常較保守，其特異性引物擴增具有良好的重復性和保真性。由于大多數微衛星序列存在非轉錄區，變異頻率高，因而在品種間具廣泛位點變異。因此，真核生物基因組中微衛星分了標記的開發與利用成為一個熱點。目前對真菌微衛星的研究主要集中在動植物病原菌，食用菌SSR分子標記的開發和應用還非常少(張瑞穎等2010)，多用在香菇、草菇、靈芝屬上，如200710040319、201110146770、200810204544、200810204545、200810204550等，在姬松茸目前還沒有開發使用的SSR分子標記，無法利用SSR分子標記進行快速的菌株鑒別。

目前已報道的主要開發食用菌SSR引物的途徑有3條:一是基于DNA序列數據設計開發SSR引物。這對于己經擁有豐富EST或基因組DNA序列數據的食用菌是非常快捷的途徑。二是基于ISSR抑制PCR的方法開發微衛星標記。其有過成功的報道，但也有報道稱利用該方法開發金針菇和黑木耳的SSR位點，結果非常不理想。可能是由于真菌基因組中SSR的分布密度相對較低，所以ISSR擴增產物并非完全是SSR之間的序列，這導致該方法獲得的序列中假陽性比較高(張瑞穎等2010)。三是近年來開發出的利用生物素標記SSR探針，與基因組DNA片段雜交后，用抗生物素蛋白吸附雜交片段以富集含SSR序列的基因組片段的方法。

發明內容

本發明的目的是提供三種姬松茸SSR分子標記其制備方法及使用其鑒別姬松茸菌株的方法，其克服了現有技術中暫無開發使用的姬松茸SSR分子標記，無法利用SSR分子標記對其進行快速的菌株鑒別的問題，具有多態性穩定、檢測快速、使用方便的特點。

三種姬松茸SSR分子標記引物的序列如下①引物E?5’-GTCAATGGAAGGGGT-3’和5’-CATCACCACACACACA-3’；?②引物G?5’-CCGCTTGGGTTTCATCT-3’和5’-CA?AACGCCTCAACCTCA-3’；③引物K?5’-CACCGGCGACCTGTA-3’和5’-CGCTGTGGGTATTGAAATGGT-3’。上述無開發出的姬松茸SSR分子標記填補了目前的姬松茸SSR分子標記的空白，使得利用SSR分子標記對姬松茸進行快速菌株鑒別成為可能。

????上述三種姬松茸SSR分子標記的制備方法包括以下步驟：

???⑴、CTAB?法提取姬松茸基因組DNA：①、稱取0.1g姬松茸Co⁶⁰輻射誘變菌株J2～J66的菌絲或子實體，用去離子水沖洗干凈后，迅速轉入1.5ml離心管中；②、加入液氮，迅速用電鉆搗碎，后加入600mlCTAB?并于65℃水浴1h，并每20min反轉搖勻一次；③、加入等體積調制的氯仿-異戊醇，使步驟（1）②獲得的溶液與氯仿-異戊醇體積比24:1，顛倒混勻后，于12000rpm離心6min，取上清液于新管中；④、向上清液中加入其2倍體積的無水乙醇或其2/3體積的異丙醇，于-20℃放置20min，用以沉淀DNA；⑤、步驟（1）④的溶液于12000rpm離心6min，去上清液后，加入75％乙醇清洗DNA于12000rpm離心2min后，再次去上清液；⑥、將步驟（1）⑤制得的DNA風干后加入50μl的TE緩沖液以溶解DNA備用；由于CTAB法對于不同作物的提取方法略有不同，上述方法是對傳統CTAB?方法改良后的基因組DNA提取方法，使用該方法提取的姬松茸基因組DNA得率更高。