[發(fā)明專利]用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)GLP-1人重組蛋白方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310157742.0
• 申請(qǐng)日: 2013-05-02
• 公開（公告）號(hào): CN103243118A
• 公開（公告）日: 2013-08-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓志強(qiáng);王凌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 韓志強(qiáng);王凌
• 主分類號(hào): C12N15/81
• 分類號(hào): C12N15/81;C12N1/19;C12N15/16;C07K14/605;C12R1/84
• 代理公司: 南通市永通專利事務(wù)所 32100
• 代理人: 葛雷

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種表達(dá)GLP-1人重組蛋白方法。

背景技術(shù)

畢赤酵母（Pichia?Pastoris）是一種甲基營(yíng)養(yǎng)型啤酒酵母菌株。由于缺乏較好的在細(xì)菌內(nèi)高效表達(dá)真核細(xì)胞重組蛋白系統(tǒng)，畢赤酵母（Pichia?Pastoris）正逐漸成為首選的外源性蛋白表達(dá)系統(tǒng)。應(yīng)用這一系統(tǒng)，有很多重組蛋白已成功被表達(dá)。但部分蛋白質(zhì)，單肽及前肽體仍然不能被有效地表達(dá)和生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種能高效表達(dá)GLP-1人重組蛋白的用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)GLP-1人重組蛋白方法。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：

一種用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)GLP-1人重組蛋白方法，其特征是：包括載體構(gòu)建和建立畢赤酵母表達(dá)GLP-1菌株；為構(gòu)建表達(dá)載體，GLP-1相關(guān)基因序列以GLP-1基因引物用PCR酶連反應(yīng)法獲取，此序列兩側(cè)設(shè)有Not?I和Xho?I酶切位點(diǎn)，PCR酶連反應(yīng)產(chǎn)物用DNA酶Not?I和Xho?I切割，然后放入pPIC9K載體質(zhì)粒產(chǎn)生?pPIC9K-GLP亞克隆；建立畢赤酵母表達(dá)GLP-1菌株pSS，用PCR方法，用殺手毒素分泌信號(hào)肽，代替啤酒酵母MATa?蛋白肽前體，從而產(chǎn)生畢赤酵母表達(dá)GLP-1菌株。

本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，易操作，能高效表達(dá)GLP-1人重組蛋白，最終產(chǎn)品GLP-1表達(dá)蛋白約?30mg/ml?及?99.9%純度，可以進(jìn)一步做生化及生物活性試驗(yàn)。

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

具體實(shí)施方式

一種用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)GLP-1人重組蛋白方法，包括載體構(gòu)建和建立畢赤酵母表達(dá)GLP-1菌株；為構(gòu)建表達(dá)載體，GLP-1相關(guān)基因序列以GLP-1基因引物用高效PCR酶連反應(yīng)法獲取。此序列兩側(cè)設(shè)有Not?I和Xho?I酶切位點(diǎn)。PCR酶連反應(yīng)產(chǎn)物用DNA酶Not?I和Xho?I切割，然后放入pPIC9K載體質(zhì)粒產(chǎn)生?pPIC9K-GLP亞克隆。建立畢赤酵母（Pichia?Pastoris）表達(dá)GLP-1菌株pSS，用PCR方法，用殺手毒素分泌信號(hào)肽，代替啤酒酵母MATa?蛋白肽前體，從而產(chǎn)生畢赤酵母表達(dá)GLP-1菌株。結(jié)果的表達(dá)菌株的DNA基因序列被確認(rèn)。酵母的生長(zhǎng)，GLP-1基因的轉(zhuǎn)化，陽性克隆的篩選，及被選基因蛋白的純化都按照?Invitrogen?生命科學(xué)公司的工作程序，在此省略。最終產(chǎn)品GLP-1表達(dá)蛋白約?30mg/ml?及?99.9%純度，可以進(jìn)一步做生化及生物活性試驗(yàn)。