[發(fā)明專利]一種基因打靶系統(tǒng)

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310157216.4
• 申請日: 2013-04-28
• 公開（公告）號: CN103224947A
• 公開（公告）日: 2013-07-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 夏海濱;張偉鋒;劉思也
• 申請（專利權(quán)）人: 陜西師范大學(xué)
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63
• 代理公司: 西安永生專利代理有限責(zé)任公司 61201
• 代理人: 申忠才

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基因打靶系統(tǒng)。

技術(shù)背景

基因組的靶向修飾包括對基因組內(nèi)源性基因序列的改造或者在基因組的特定位置插入外源性基因片段。這項(xiàng)技術(shù)為研究特定基因功能提供了有力工具，此外研究人員可以利用該技術(shù)建立特定的動物模型來進(jìn)行基因功能研究或新藥物的研發(fā)。傳統(tǒng)的基因靶向修飾技術(shù)是依賴于自然狀態(tài)下的同源重組（Homologous?recombination，HR），效率非常低，大約為10^-6，因而大大限制了該技術(shù)的應(yīng)用。近幾年來鋅指核酸酶（Zinc?finger?nucleases,ZFN）、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶（Transcription?activator-like?effector?nucleases，TALEN）、RNA介導(dǎo)的Cas9核酸酶（RNA:Cas9）等位點(diǎn)特異性切割核酸酶技術(shù)的出現(xiàn)給基因組靶向修飾帶來了希望。

ZFN、TALEN、RNA:Cas9等位點(diǎn)特異性切割核酸酶技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)新的技術(shù)，通過人工設(shè)計(jì)的ZFN、TALEN或sgRNA:Cas9在基因組DNA的特定位置切割產(chǎn)生雙鏈斷裂（DSB），繼而通過細(xì)胞內(nèi)源性的修復(fù)機(jī)制對斷裂部位的基因進(jìn)行修飾。同自然狀態(tài)下的同源重組技術(shù)相比較，該技術(shù)可以使基因組靶向修飾的效率提高了10³～10⁵倍。位點(diǎn)特異性切割核酸酶介導(dǎo)的基因定點(diǎn)修飾已經(jīng)在多種體外培養(yǎng)的細(xì)胞中獲得成功，包括人的胚胎干細(xì)胞(embryonic?stem?cell,ES)和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced?pluripotent?stem?cells,iPS)、植物、果蠅、爪蟾、線蟲、斑馬魚、小鼠、大鼠等的細(xì)胞，顯示出該技術(shù)的廣泛適用性，這將有力地推動基因靶向修飾技術(shù)的應(yīng)用研究。

位點(diǎn)特異性切割核酸酶介導(dǎo)的基因靶向修飾需要將位點(diǎn)特異性切割核酸酶和供體DNA同時導(dǎo)入到靶細(xì)胞中，其中對供體DNA的需求量要高于位點(diǎn)特異性切割核酸酶，多數(shù)情況下將位點(diǎn)特異性切割核酸酶和供體DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞的比例為1:5～1:10，如何有效提高將供體DNA導(dǎo)入到靶細(xì)胞中的效率成為影響基因靶向修飾效率的重要因素，尤其是對于那些轉(zhuǎn)染效率低的細(xì)胞或者在體內(nèi)基因靶向修飾中。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服上述供體DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞效率的不足，提供一種能產(chǎn)生多個供體DNA片段、效率高的基因打靶系統(tǒng)。

解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：由位點(diǎn)特異性切割核酸酶表達(dá)載體和打靶載體兩部分組成。本發(fā)明的打靶載體包含2～10個供體DNA片段，每個供體DNA片段的5＇端和3＇端分別插入位點(diǎn)特異性切割核酸酶的識別序列，供體DNA由上游同源臂、下游同源臂和位于兩者之間的外源DNA序列組成。上述的位點(diǎn)特異性切割核酸酶表達(dá)載體是攜帶鋅指核酸酶的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶的表達(dá)載體、RNA介導(dǎo)的核酸酶RNA:Cas9的表達(dá)載體中的任意一種。

本發(fā)明的位點(diǎn)特異性切割核酸酶的識別序列是基因組上位點(diǎn)特異性切割核酸酶結(jié)合的長度為20bp～50bp的DNA序列。

本發(fā)明的外源DNA序列是長度為1bp～3000bp的DNA片段。

本發(fā)明的上游同源臂、下游同源臂是分別與位點(diǎn)特異性切割核酸酶識別位點(diǎn)上游和下游的部分基因組序列同源的兩段長度為50bp～3000bp的DNA片段。

本發(fā)明的部分基因組序列是距離鋅指核酸酶識別位點(diǎn)1bp～3000bp的DNA序列。

本發(fā)明采用由位點(diǎn)特異性切割核酸酶表達(dá)載體和攜帶多個供體DNA片段的打靶載體組成的基因打靶系統(tǒng)，在供體DNA片段之間引入了位點(diǎn)特異性切割核酸酶的識別序列，通過位點(diǎn)特異性切割核酸酶在細(xì)胞內(nèi)對打靶載體的切割產(chǎn)生多個供體DNA片段，有效地提高供體DNA進(jìn)入靶細(xì)胞的水平，從而提高基因打靶的效率。

附圖說明

圖1.是AAVS1ZFN表達(dá)載體結(jié)構(gòu)圖。

圖2是AAVS11000F供體DNA結(jié)構(gòu)圖。

圖3.是攜帶多個供體DNA片段的打靶載體結(jié)構(gòu)圖。

圖4是pE1/EGFP/4×AAVS1-TSF-Donor靶向修飾效率檢測。

圖5是CCR5ZFN表達(dá)載體結(jié)構(gòu)圖。

圖6是攜帶SNCA?ZFN表達(dá)元件的腺病毒結(jié)構(gòu)圖。

圖7是攜帶靶向SNCA位點(diǎn)的供體DNA的腺病毒結(jié)構(gòu)圖。