[發(fā)明專(zhuān)利]辣椒輕斑駁病毒反轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)用引物及其應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310154789.1
• 申請(qǐng)日: 2013-04-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103215383A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-07-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃天培;廖富榮;關(guān)雄;方志鵬;吳媛;郭木金
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/70
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)，具體地說(shuō)涉及辣椒輕斑駁病毒反轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）檢測(cè)引物、檢測(cè)方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

辣椒輕斑駁病毒（Pepper?mild?mottle?virus,?PMMoV）是一種正單鏈RNA的桿狀病毒，屬于桿狀病毒科（Virgaviridae）、煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）成員，在世界范圍內(nèi)廣泛分布，是辣椒上最重要的可經(jīng)種子傳播的病原之一。PMMoV雖然在辣椒葉片上產(chǎn)生輕微或沒(méi)有產(chǎn)生癥狀，但能引起果實(shí)退綠斑駁、畸型、變小，偶爾壞死，嚴(yán)重影響辣椒的產(chǎn)量和品質(zhì)。此外，該病毒還可能是一個(gè)能夠同時(shí)感染人類(lèi)的植物病毒，已有報(bào)道指出該病毒與人的發(fā)熱、腹部疼痛、瘙癢有關(guān)，并引起免疫反應(yīng)。在我國(guó)，1989年報(bào)道在遼寧的辣椒上發(fā)生，1994年報(bào)道在新疆石河子辣椒上危害，而后發(fā)生危害的報(bào)道很少。但近5年來(lái)，先后在陜西、北京、寧夏、山東青島、河北保定等地的辣椒上發(fā)現(xiàn)該病毒，具有危害地區(qū)越來(lái)越廣、危害面積也在逐年增加的趨勢(shì)。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated?isothermal?amplification，LAMP）是一種在等溫條件下高特異性、高靈敏性、快速地?cái)U(kuò)增DNA的核酸擴(kuò)增方法。與傳統(tǒng)的分子檢測(cè)方法相比，該方法具有以下幾個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn)：1）一般情況下，LAMP方法比傳統(tǒng)的PCR方法具有更高的靈敏度高；2）由于LAMP通過(guò)4對(duì)引物與靶序列上的6個(gè)特異部位準(zhǔn)確結(jié)合來(lái)產(chǎn)生擴(kuò)增效應(yīng)，因此能獲得比PCR更高的特異性；3）LAMP是恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，沒(méi)有PCR反應(yīng)中溫度變化的耗時(shí)，通常在30?min-60?min內(nèi)即可完成反應(yīng)過(guò)程；4）LAMP反應(yīng)只需要恒溫孵育器（或恒溫水浴槽），設(shè)備簡(jiǎn)單，不需要更為昂貴的PCR儀；5）產(chǎn)物檢測(cè)便捷多樣，即可根據(jù)反應(yīng)體系中是否形成白色的焦磷酸鎂沉淀來(lái)定性判斷，也可加入染料后進(jìn)行顏色反應(yīng)判定，或瓊脂糖凝膠電泳判定，或利用LAMP實(shí)時(shí)濁度儀或?qū)崟r(shí)熒光PCR系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)判定。LAMP自從2000年誕生以來(lái)，已在植物病害檢測(cè)中得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，包括植物病原細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)等有害生物、轉(zhuǎn)基因的檢測(cè)中。

目前，除了利用傳統(tǒng)的鑒別寄主、生理生化特征、電鏡技術(shù)等常規(guī)方法進(jìn)行PMMoV的檢測(cè)鑒定外，還可以利用已建立的RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR、基于DIG標(biāo)記cDNA探針的分子雜交等分子檢測(cè)方法，但還沒(méi)有有關(guān)RT-LAMP方法的報(bào)道。本發(fā)明根據(jù)PMMoV基因組序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，經(jīng)條件優(yōu)化后，建立了PMMoV的RT-LAMP方法，為PMMoV的快速檢測(cè)提供一種新的分子檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提供用于辣椒輕斑駁病毒RT-LAMP檢測(cè)的引物序列及其應(yīng)用。所述RT-LAMP檢測(cè)，即辣椒輕斑駁病毒反轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn)的。

本發(fā)明通過(guò)分析已報(bào)道的PMMoV基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物。所述的引物對(duì)由1對(duì)外引物和1對(duì)內(nèi)引物組成，其外引物序列為PMMoV-F3：如SEQ?ID?NO：1所示，即為5’-?CAGGTGGACTTCGGTCTT?-3’、PMMoV-B3：如SEQ?ID?NO：2所示，即為5’-?CAAGCTTTGAAAGGTACAGT?-3’；其內(nèi)引物為PMMoV-FIP：如?SEQ?ID?NO：3所示，即為5’-?ATTTCCCCCGATATCATATGTCGTGGAACTAGAATACTTGATGATGC-3’、?PMMoV-BIP:?如SEQ?ID?NO：4所示，即為5’-?GTCGTGACTACGTTCATTGCTGTCAATGCTATCCTTTTGAGC-3’。

本發(fā)明還進(jìn)一步提供了應(yīng)用上述引物的RT-LAMP檢測(cè)方法，其以樣品總RNA為模板，進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)是否產(chǎn)生典型的梯狀條帶判定結(jié)果。

本發(fā)明的反應(yīng)條件可由兩步RT-LAMP法或一步RT-LAMP法進(jìn)行，其特征在于：

（1）兩步RT-LAMP法的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和LAMP擴(kuò)增反應(yīng)兩個(gè)過(guò)程分開(kāi)進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的溫度為42℃，LAMP擴(kuò)增溫度為65?℃；

（2）一步RT-LAMP法的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和LAMP擴(kuò)增反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，一步RT-LAMP法的反應(yīng)溫度為60?℃。

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