[發明專利]用于檢測肝癌血清特征蛋白的指紋圖譜模型及其制備方法

無效

• 申請號: 201310154536.4
• 申請日: 2013-04-28
• 公開（公告）號: CN103383374A
• 公開（公告）日: 2013-11-06
• 發明（設計）人: 廖劍;殷正豐;蘭小鵬;錢海華;王開宇
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍南京軍區福州總醫院
• 主分類號: G01N27/62
• 分類號: G01N27/62
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明涉及蛋白質指紋圖譜檢測技術領域，特別是一種用于檢測肝癌血清特征蛋白的指紋圖譜模型及其制備方法。

背景技術

我國是乙型肝炎病毒（HBV）高感染的國家之一。由HBV?導致的肝癌死亡率高，手術治療后5年生存率較低。顯著提高治療效果的有效手段是早期診斷。目前常用的肝癌實驗初檢方法是血清AFP含量測定，但是其靈敏度和特異性都不高。研究發現，肝癌血清AFP蛋白發生高度巖藻糖基化，并且特異性高。檢測這部分AFP（AFP-L3）可以大大提高肝癌診斷水平。但是，鑒于約有一半肝癌患者血清AFP值為陰性，使其臨床應用受到限制。

研究者發現，肝癌中糖蛋白的異常巖藻糖基化可能不僅僅限于AFP，血清轉鐵蛋白、高爾基蛋白73等在肝癌中也發生了巖藻糖基化變化，說明肝癌血清中可能存在著許多巖藻糖基化異常的蛋白，而這些蛋白可能作為新的肝癌診斷標志物。因此，進一步篩選、鑒定這些糖蛋白，并發現新的肝癌標志物和治療靶標是當前肝癌臨床現狀的迫切需要。目前肝癌早期診斷水平亟待提高的主要原因是通常只依靠一兩個實驗指標，而包括AFP在內的現有指標的特異性和靈敏度都不能完全滿足臨床需要。如果能同時分析比對一組肝癌相關蛋白或糖基化異常糖蛋白，則能大大提高診斷水平。

雙向電泳技術雖能同時檢測一組蛋白，但因其無法檢測低豐度和小分子量的蛋白以及操作繁瑣使其無法應用于臨床。近十年來美國賽弗吉生物系統公司（Ciphergen?Biosystem?Inc.）提供的表面增強激光解吸/電離飛行時間質譜技術（Surface?enhanced?laser?desorption/?ionization?time?of?flight?mass?spectrometry,?SELDI-TOF-MS）可以同時對樣本中的一組蛋白進行檢測分析，已有用于腫瘤標記物的篩查和臨床檢測的報道，但是其檢測同一標本重復性不穩定的問題使其遭受眾多科研和醫務工作者的質疑。而德國布魯克·道爾頓公司（Bruker?Daltonics?Inc.）與美國哈佛大學醫學院、美國休斯敦貝勒醫學院利用飛行時間質譜技術（MALDI-TOF-MS）共同開發研究的液體蛋白芯片指紋圖譜解決方案(CLINPORT系統)解決了SELDI-TOF-MS技術重復性不好穩定性不高的缺陷。該系統具有諸多優勢：（1）多種不同表面性質的磁珠可供選擇；（2）重復性好；（3）樣品需求量少；（4）靈敏度高，低豐度蛋白也可以檢測到；（5）大規模，高通量，可以在短時間內快速全自動完成檢測；（6）不僅可發現一種蛋白質或生物標記分子，而且可發現不同的多種方式的組合蛋白質模式，并能直接用于臨床檢測。新近已有將CLINPROT技術應用于腫瘤研究的報道，如鼻咽癌、膀胱癌、子宮頸癌、頭頸鱗癌和胰腺癌等。但是根據糖蛋白質組學原理應用CLINPROT技術建立肝癌血清巖藻糖基化異常糖蛋白質組指紋圖譜模型迄今國內外均未見報道。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種用于檢測肝癌血清特征蛋白的指紋圖譜模型及其制備方法，該模型為肝癌的早期診斷提供了新的方法，并為進一步發現新的腫瘤標記物提供了基礎，有利于提高肝癌診斷的準確性。

本發明的目的是采用如下技術方案實現的：一種用于檢測肝癌血清特征蛋白的指紋圖譜模型，從血清中篩選出4個上調蛋白和3個下調蛋白共7個巖藻糖基化異常糖蛋白作為特征蛋白質組，以所述特征蛋白質組為組成，建立用于檢測肝癌血清特征蛋白的指紋圖譜模型；所述4個上調蛋白分別為：分子量為9290.06道爾頓，分子量為2660.24道爾頓，分子量為2764.18道爾頓，分子量為1862.71道爾頓；所述3個下調蛋白分別為：分子量為4282.99道爾頓，分子量為3963.52道爾頓，分子量為6023.31道爾頓。

本發明還提供了一種用于檢測肝癌血清特征蛋白的指紋圖譜模型的制備方法，包括以下步驟：

1）收集多例經病理和DNA檢查明確診斷的原發性肝癌患者血清作為肝癌組的血清標本；已確診的肝硬化患者的血清，已確診的肝炎患者的血清以及經體檢確定為健康者的血清作為非肝癌組的血清標本，進行低溫冷凍備用；

2）采用可以特異吸附巖藻糖基化異常糖蛋白的MB-LAC?LCA磁珠對上述肝癌組及非肝癌組的血清標本的糖蛋白進行吸附，隨后將特異吸附的糖蛋白洗脫下來備用；

3）將上述步驟中洗脫下來的兩組血清標本中特異吸附的糖蛋白在專用芯片上進行讀取，獲得兩組蛋白指紋圖譜；

4）對所述兩組蛋白指紋圖譜進行標準化處理，并收集數據；