[發明專利]一種新型表皮生長因子及其應用

無效

• 申請號: 201310154148.6
• 申請日: 2013-04-28
• 公開（公告）號: CN103204920A
• 公開（公告）日: 2013-07-17
• 發明（設計）人: 趙寶全;李前;孫曼霽
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院毒物藥物研究所
• 主分類號: C07K14/485
• 分類號: C07K14/485;C12N15/12;C12N15/63;C12N1/21;C12N1/19;C12P21/02;A61K38/18;A61K48/00;A61P25/28;A61P25/16;A61P43/00;C12R1/19
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 孫式洪

技術領域

本發明涉及人源表皮生長因子的突變體及其用途。

技術背景

表皮生長因子是1962年Cohen和Montalcini教授在小鼠頜下腺中發現的一種熱穩定蛋白，其具有促使新生小鼠眼瞼早開、牙齒早萌的作用。將這一活性成分加入培養皮膚表皮的基質中，發現它可直接促進皮膚表皮的生長，因此，將這一活性組分命名為“表皮生長因子(epidermal?growth?factor,EGF)。

人源表皮生長因子（hEGF）是由53個氨基酸殘基組成的單鏈多肽。人源表皮生長因子因其對消化道潰瘍、皮膚燒傷、創傷愈合等諸多方面均具有較強的藥理學作用而倍受關注。自從1986年闡明了其核苷酸序列以來，分別在大腸桿菌、枯草桿菌和酵母菌中得到了成功表達。但是人源表皮生長因子的表達生產多數以包涵體形式表達，而包涵體形式的表皮生長因子不具有生物學活性，只有通過變性復性等方法獲得可溶性蛋白。包涵體的變性復性非常復雜，效率極低，有些又不能完全復性，導致復性后的人表皮生長因子的生物學活性較低，嚴重制約了生物制藥業的發展。

發明內容

包涵體的形成原因有多種，主要因為在重組蛋白的表達過程中缺乏某些蛋白質折疊的輔助因子，或環境不適，無法形成正確的次級鍵等原因形成的，其中二硫鍵錯配可能是原因之一。

正常的人源表皮生長因子（hEGF）分子內含有六個半胱氨酸，形成三個鏈內二硫鍵，并且三個二硫鍵的位置固定，增加了形成包涵體的幾率。為了解決人表皮生長因子主要以包涵體的形式表達這一技術問題，本發明利用將人源表皮生長因子的半胱氨酸進行突變，獲得了可溶表達的突變的人源表皮生長因子及其核苷酸序列。

本發明一方面提供了突變的人源表皮生長因子，其特征在于人源表皮生長因子的半胱氨酸被絲氨酸取代（命名mu-1），其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

本發明另一方面提供了突變的人源表皮生長因子，其特征在于人源表皮生長因子的半胱氨酸被丙氨酸取代（命名mu-2），其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：3所示。

本發明另一方面提供了突變的人源表皮生長因子，其特征在于人源表皮生長因子的半胱氨酸被完全去除（命名mu-3），其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：5所示。

利用生物工程技術，對上述本發明的突變的人源表皮生長因子蛋白進行表達，結果發現，mu-1表達蛋白形成大量的包涵體，但生物活性良好；mu-2和mu-3完全可溶。生物學活性好。

本發明的另一方面還提供了編碼本發明的人源表皮生長因子的核苷酸序列。

優選地，編碼本發明的人源表皮生長因子的核苷酸序列包含：

a)SEQ?ID?NO.2、4或6中所示的核苷酸序列；

b)在嚴緊條件下與由SEQ?ID?NO.2、4或6的核苷酸序列進行雜交、且編碼具有本發明的突變的人源表皮生長因子活性的氨基酸序列的多核苷酸；或

c）上述a）或b）的互補序列。

本文中，具有本發明的突變的人源表皮生長因子活性是指某一蛋白質或氨基酸序列的活性是SEQ?ID?NO.1、3或5的10％以上、20％以上、40％以上、60％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、或100％或更高。

本文所述的“嚴緊條件”，可以為低嚴緊條件、中嚴緊條件、高嚴緊條件中的任一種，優選為高嚴緊條件。示例性地，“低嚴緊條件”可為30℃、5×SSC、5×Denhardt液、0.5%SDS、52%甲酰胺的條件；“中嚴緊條件”可為40℃、5×SSC、5×Denhardt液、0.5%SDS、52%甲酰胺的條件；“高嚴緊條件”可為50℃、5×SSC、5×Denhardt液、0.5%SDS、52%甲酰胺的條件。本領域技術人員應當理解溫度越高越能得到高同源性的多核苷酸。另外，本領域技術人員可以選擇影響雜交的嚴緊度的溫度、探針濃度、探針長度、離子強度、時間、鹽濃度等多個因素形成的綜合結果來實現相應的的嚴緊度。