[發明專利]牛布魯氏菌重組菌株S19-Δbp26-BL及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201310153715.6
• 申請日: 2013-04-27
• 公開（公告）號: CN103289986A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 陳金頂;王佳瑩;常艷;趙明秋;吳云燕
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N1/21;A61K39/10;A61P31/04;C12R1/01
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運貞;裘暉

技術領域

本發明涉及到重組細菌疫苗領域，特別涉及一種牛布魯氏菌（Brucella?abortus）重組菌株S19-Δbp26-BL及其制備方法與應用，該菌株是在缺失其bp26基因的位置插入自身兩個主要免疫原性基因BLS和L7/L12得到。

背景技術

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的人獸共患傳染病，防控該病一直是以應用疫苗進行預防為主。布魯氏菌疫苗種類較多，重組蛋白疫苗與DNA疫苗保護性有限，滅活疫苗保護期短。目前用于布魯氏菌病防控的減毒菌株主要有國外的牛型19號弱毒菌株（S19）和羊型ReV.1弱毒菌株，國內研制的羊型5號（M5）弱毒菌株和豬型2號（S2）弱毒菌株。弱毒苗造價便宜，免疫保護持續時間長，免疫保護效率高，但是這些弱毒疫苗同樣存在缺陷。這些光滑型布魯氏菌弱毒疫苗免疫動物后，會在動物機體誘導產生S-LPS抗原“O”鏈特異性抗體，很難與野毒株布魯氏菌感染相區分，干擾常規布魯氏菌病的診斷。如果廣泛應用這樣的疫苗就對該病流行病學調查、探查疫源產生很大的障礙。許多國家與地區限制布魯氏菌血清學方法檢測呈陽性動物的肉制品、奶制品進出口，給國際貿易產生嚴重的阻礙，特別是對牧區經濟產生重要的影響。除此之外，現有的布魯氏菌的減毒活疫苗都對動物會產生不同程度的副作用，再引起動物輕度流產的同時也會感染人類。所以構建安全性高、無返祖、能區分自然感染與人工主動免疫、保護性能好的布魯氏菌標記弱毒疫苗是當務之急。

BP26蛋白是一種具有強免疫原性的外周漿蛋白，且幾乎存在于所有布魯菌菌株中。研究表明BP26蛋白具有良好的免疫活性，自然感染或人工免疫后都可以在血清中檢測出針對此抗原的特異性抗體。bp26基因的缺失對布魯氏菌的毒力和免疫原性幾乎沒有影響，并不會影響細菌本身的生長繁殖。

L7/L12編碼的核蛋白在布魯氏菌的核糖體亞單位中以四個拷貝的形式存在，其氨基末端可與L10核糖體蛋白形成二聚體，羧基末端在多肽合成的延伸過程中，可以與延伸因子EF-TU和EF-G相結合，并在GTP水解過程中發揮重要作用。研究發現，從布魯氏菌中提取的L7/L12蛋白能特異性地刺激感染動物的單核細胞，并上調INF-γ的轉錄和表達，從而起到保護作用。BLS編碼2,4-二氧四氫蝶啶合成酶，此蛋白酶以二聚體的形式形成五聚物，60個亞單位可以排列成20面體衣殼形式，有類似于霍亂毒素（CT）的佐劑作用，而在安全性和激活Thl型為主的免疫反應方面BLS又強于CT，BLS重組質粒免疫動物，可產生IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM等多種特異性抗體，用布魯氏菌544A攻毒，可顯著降低細胞負荷。2007年，Juliana?Cassataro（Improved?Immunogenicity?of?a?Vaccination?Regimen?Combining?a?DNA?Vaccine?Encoding?Brucella?melitensis?Outer?Membrane?Protein31(Omp31)and?Recombinant?Omp31Boosting.Clin?Vaccine?Immunol.2007,14(7):869–874.）等，將Omp31的loop區的27個氨基酸連于BLS，重組蛋白免疫B1LB/c小鼠，用綿羊附睪型布魯氏菌攻毒，保護性與ReV.1疫苗相當，可見BLS不僅有特異性的免疫保護，還有佐劑效應。

發明內容

本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種牛布魯氏菌重組菌株S19-Δbp26-BL的制備方法。

本發明的另一目的在于提供通過上述制備方法得到的牛布魯氏菌重組菌株S19-Δbp26-BL。

本發明的再一目的在于提供上述牛布魯氏菌重組菌株S19-Δbp26-BL在制備用于治療和/或預防布魯氏菌病的疫苗中的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種牛布魯氏菌重組菌株S19-Δbp26-BL的制備方法，包括以下步驟：

（1）自殺性同源重組質粒的構建

①以牛布魯氏菌S19基因組DNA為模板做PCR擴增，用引物P1和P2擴增，得到bp26基因的上游同源臂；用引物P3和P4擴增，得到bp26基因的下游同源臂；用引物B1/B2擴增，得到BLS基因；用引物B3/B4擴增，得到L7/L12基因；

P1：5’-GATGGTACCCGATGCAGCAAGACAGTATT-3’（橫線部分為KpnI酶切位點）；