[發明專利]鑒別豬瘟病毒強毒株和疫苗弱毒株的RT-PCR檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201310153667.0
• 申請日: 2013-04-28
• 公開（公告）號: CN103205510A
• 公開（公告）日: 2013-07-17
• 發明（設計）人: 郭抗抗;劉偉;張彥明;寧蓬勃;王晶鈺;姜艷芬;王濤
• 申請（專利權）人: 郭抗抗
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種試劑盒，具體地說，涉及一種鑒別豬瘟病毒強毒株和疫苗弱毒株的RT-PCR檢測試劑盒。

背景技術

豬瘟(Classical?swine?fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical?swine?fever?virus，CSFV)引起豬的一種高度接觸性和致死性傳染病。世界各國對豬瘟都采取嚴格的防控措施，歐盟國家普遍采取對豬瘟病毒感染豬和豬瘟患病豬進行撲殺的政策，只有在有證據表明出現豬瘟擴散的情況下才采取疫苗的緊急免疫接種。在大多數存在養豬業的發展中國家，采取疫苗免疫接種是防控豬瘟的一項基本措施，豬瘟兔化弱毒疫苗(HCLV株，又稱C-株)是中國在20世紀50年代發明的一個優秀的豬瘟弱毒活疫苗，其具有免疫保護確實，對懷孕母豬安全性好的優點，為豬瘟的防控起到了重要作用。但是，目前豬瘟在世界范圍內仍有發生，特別是近二十年來豬瘟的流行特點發生了明顯的變化，臨床上以母豬流產、仔豬長期帶毒等“非典型性豬瘟”和“慢性豬瘟”為主，主要原因是由于仔豬母源抗體的干擾和免疫耐受而造成免疫失敗，使得豬瘟病毒野毒進入免疫豬群和無豬瘟豬群，引起豬群發病，造成嚴重的經濟損失。豬群中抗豬瘟病毒免疫抗體的高低是評價豬瘟疫苗免疫效果和豬群是否獲得免疫保護的重要指標，但常規的血清學方法只能檢測出抗豬瘟病毒抗體水平的高低，并不能區分高水平抗豬瘟病毒抗體的產生是由于豬瘟病毒強毒感染還是疫苗免疫接種激發的。通過敏感、特異、有效的方法來鑒別豬瘟病毒強毒感染豬和疫苗免疫豬，將豬瘟病毒強毒感染豬從豬群中剔除，建立無豬瘟病毒感染豬群是當前豬瘟防控的重要措施。

在中國，豬瘟病毒石門株是流行毒株的代表，目前在豬群中也存在一些來自歐洲的豬瘟病毒株，使得國內豬群中豬瘟病毒流行毒株呈現較為復雜的狀況，對豬瘟的防控帶來了較大困難。研究可鑒別豬瘟病毒強毒株和疫苗弱毒株(C-株)的抗原檢測方法，發現豬瘟弱毒疫苗免疫豬群中的豬瘟病毒強毒感染豬，進而對其進行凈化處理，是豬瘟防控的重要工作。國內外建立了多種豬瘟病毒強毒株(野毒株)和疫苗弱毒株的鑒別檢測方法，如套式RT-PCR、實時熒光定量RT-PCR、多重RT-PCR等，但還未見到研制成豬瘟病毒強毒株和疫苗弱毒株鑒別檢測試劑盒的報道。本課題組在對豬瘟病毒石門株、流行毒株和疫苗弱毒株(C-株)全基因序列比對分析的基礎上，篩選強毒株和弱毒株的差異基因序列設計引物，建立了鑒別豬瘟病毒強毒株和疫苗弱毒株的RT-PCR檢測方法。

為了更便于一般檢測實驗室、生豬養殖單位和動物疫病防控機構等利用建立的方法對豬群中豬瘟病毒強毒感染豬和弱毒疫苗免疫豬進行鑒別檢測。本研究對RT-PCR的反應體系、反應條件和組分進行了優化，組裝成一種使用方便、快速，適用于豬瘟病毒強毒株和疫苗弱毒株鑒別的RT-PCR檢測試劑盒。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明提供一種鑒別豬瘟病毒強毒株和疫苗弱毒株的RT-PCR試劑盒。在建立高靈敏度和特異性RT-PCR方法的基礎上，通過對試劑成分的整合，組裝成可以快速檢測鑒別豬瘟病毒強毒感染豬和疫苗免疫豬的試劑盒，可用于臨床樣品和病毒感染的細胞培養物的檢測。

其技術方案如下：

一種鑒別豬瘟病毒強毒株和疫苗弱毒株的RT-PCR檢測試劑盒，其組成成分包括：A.反轉錄組合RT、B.PCR組合、C.稀釋液、D.陽性對照：

A.反轉錄組合由A1和A2成分組成，A1分別含5×PrimeScript?Buffer、Oligo?dT、Primer?Random?6?mers，其體積比為4∶1∶4，共250μL；A2為PrimeScript?RT?Enzyme?Mix?I反轉錄酶5U/μL，共30μL；

B.PCR組合由B1、B2、B3三種成分組成，B1為2×PCR預混液，共1000μL；B2為豬瘟病毒強毒上游引物SF、弱毒上游引物CF混合物(10μmol/L)，共60μL；B3為豬瘟病毒強毒下游引物SR、弱毒下游引物CR混合物(10μmol/L)，共60μL；

C.稀釋液為焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的滅菌水，共1000μL；

D.陽性對照為滅活的豬瘟病毒石門株和C-株細胞培養物，共1000μL。

進一步優選，B2中引物混合物按照等摩爾比組成。

進一步優選，B3中引物混合物按照等摩爾比組成。