[發明專利]檢測唾液中酒精含量的固定化酶納米纖維膜的制備方法

有效

• 申請號: 201310152829.9
• 申請日: 2013-04-27
• 公開（公告）號: CN103232987A
• 公開（公告）日: 2013-08-07
• 發明（設計）人: 李孝紅;劉清杰;趙龍;嚴仕力
• 申請（專利權）人: 西南交通大學
• 主分類號: C12N11/00
• 分類號: C12N11/00;C12Q1/26;D06M15/53;D06M15/61
• 代理公司: 成都博通專利事務所 51208
• 代理人: 陳樹明

技術領域

本發明屬于酒精濃度檢測技術領域，特別涉及一種檢測唾液中酒精含量的固定化酶納米纖維膜的制備方法。

背景技術

許多行業都需要對乙醇含量進行定性或定量檢測分析，比如各國對機動車駕駛員血液酒精含量均有嚴格要求。在我國，駕駛員血液酒精濃度達到0.2mg/ml即為酒后駕車，當酒精濃度達到0.8mg/ml則視為醉酒駕車。近些年，酒后駕車釀慘禍的悲劇屢見不鮮。盡管交通執法部門已經加大了執法力度與懲處力度，但始終有駕駛員鋌而走險；此外，也有部分駕駛員因其不能準確判斷出自身的酒精含量而違法駕駛，這給其他道路交通參與者帶來極大的安全隱患。因此，研制一種能便捷、準確檢測體內酒精含量的手段極具現實意義。

通過直接對人體血液酒精濃度進行抽樣分析檢測能準確得到酒精濃度值，但該檢測方法耗時長、費用高，且需在實驗室用專業儀器進行分析測試，不具有便捷性、廉價性。目前，交警部門執法檢查時常用呼氣酒精檢測儀來檢測推算出血液酒精濃度值，因為人體內血液酒精濃度(mg/ml)＝呼出氣體中酒精濃度(mg/ml)×2200。呼氣式檢測方法檢測時間短，具有便攜性，但由于呼出氣體中酒精濃度遠低于血液酒精濃度，導致其誤差大，準確性不好。據實驗及文獻報道證明：唾液酒精濃度(mg/ml)＝血液酒精濃度(mg/ml)×1.07，且體重、性別和年齡等因素對唾液/血液中酒精濃度的對應關系無顯著影響，這兩種體液內酒精濃度值具有良好的一致性。因此，在人體酒精濃度檢測時，除血檢和呼氣式檢測以外，還可以考慮對唾液中酒精濃度進行檢測，換算出血液酒精濃度值。

目前，已有幾種酶膜可檢測唾液中酒精濃度。如：申請號為200410041987的專利申請，用酚蘭作為顯色劑，將濾紙用乙醇脫氫酶與輔酶NAD⁺配制的混合酶液浸透后，使乙醇脫氫酶及輔酶NAD⁺物理吸附在濾紙上。檢測時將濾紙與唾液接觸，唾液中的乙醇與濾紙上吸附的乙醇脫氫酶及輔酶NAD⁺作用，生成乙醛和酶氧化底物，酶氧化底物與酚蘭指示劑作用生成藍色或紅色的產物，根據顏色變化可推算酒精濃度；申請號為200510013235的專利申請，利用四甲基聯苯胺作為顯色劑，利用被濾紙吸附的乙醇氧化酶氧化乙醇生成過氧化氫使顯色劑褪色，利用褪色程度判斷樣品酒精含量。

上述的便攜式檢測體系中使用了乙醇脫氫酶和乙醇氧化酶，制備原理均是利用物理吸附將酶固定在濾紙上。這種制備方法操作簡單，但由于濾紙質密，酶只是物理吸附在濾紙表面，導致其熱穩定性以及酸堿穩定性差，使得檢測誤差大，檢測結果不準確。同時由于濾紙表面質密，比表面積較小，吸附的酶量少且易脫落，使其檢測靈敏度低，也使其檢測誤差大。并且，乙醇氧化酶由八個亞基組成，在固定化和使用過程中酶的任一亞基脫落，均會造成酶活性不同程度的喪失，增大檢測誤差；而將八個亞基均固定在基底載體上將破壞酶的空間結構、增加酶對底物作用時的空間位阻，從而影響酶的活性，又降低其檢測靈敏度和精確度。因此，目前的固定化乙醇氧化酶檢測體系均未能實現準確、靈敏、多次重復使用等要求。

發明內容

本發明的目的是提供一種檢測唾液中酒精含量的固定化酶納米纖維膜的制備方法，該法制備出的固定化酶納米纖維膜能簡單、便捷的檢測出唾液中的酒精濃度，其檢測靈敏度高，檢測結果準確，循環使用次數多。

本發明實現其發明目的所采用的第一種技術方案是，一種檢測唾液中酒精含量的固定化酶納米纖維膜的制備方法，其步驟是：

A、用靜電紡絲法制備出表面帶氨基或羥基的納米纖維膜；

B、將A步的納米纖維膜接枝端羧基聚乙二醇，得到接枝有聚合物的納米纖維膜；

C、將B步的接枝有聚合物的納米纖維膜浸入乙醇氧化酶溶液中6-8小時、取出，得到多位點共價接枝乙醇氧化酶的納米纖維膜；

D、將接枝乙醇氧化酶的納米纖維膜浸入陽離子聚合物溶液中1-3小時、固定乙醇氧化酶的多個亞基，取出得到乙醇氧化酶亞基固定的納米纖維膜；

E、將乙醇氧化酶亞基固定的納米纖維膜浸入靛藍溶液中3-5分鐘，取出、晾干，即得。

本發明實現其發明目的所采用的第二種技術方案是，2、一種檢測唾液中酒精含量的固定化酶納米纖維膜的制備方法，其步驟是：

A、用靜電紡絲法制備出表面帶酸酐基或醛基的納米纖維膜；

B、將A步的納米纖維膜接枝聚乙烯亞胺、得到接枝有聚合物的納米纖維膜；