[發(fā)明專利]棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310152001.3
• 申請日: 2013-04-27
• 公開（公告）號: CN103255153A
• 公開（公告）日: 2013-08-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曹秋芬;孟玉平;郭慧娜;李捷;張春芬;鄧舒
• 申請（專利權(quán)）人: 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/02;A01H5/00
• 代理公司: 太原科衛(wèi)專利事務(wù)所(普通合伙) 14100
• 代理人: 朱源

技術(shù)領(lǐng)域

????本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因。

背景技術(shù)

植物生長在大自然時常遭受著各種非生物脅迫，隨著世界環(huán)境的急劇變化這種非生物脅迫越來越嚴(yán)重。抗氧化酶是植物非生物脅迫中重要的防御系統(tǒng)，它們可通過降解的方法去除活性氧來抵抗非生物脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化傷害，從而減少對植物造成的傷害。但我們對抗氧化酶的功能及結(jié)構(gòu)特性的認(rèn)識仍很有限，還需要大量的工作。因此，克隆和鑒定植物中的具有抗氧化功能的基因，研究抗逆機(jī)制以及逆境相關(guān)基因的分子結(jié)構(gòu)、表達(dá)、功能及調(diào)控，可為充分利用這些優(yōu)良抗性基因提高植物的抗逆性提供一定的實驗數(shù)據(jù)和奠定理論基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

????本發(fā)明旨在提供一種具有抗氧化功能的基因——棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因，其可作為目的基因?qū)胫参铮岣咧参锟鼓嫘裕M(jìn)行植物品種改良。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：一種棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因，該基因的核苷酸序列是如SEQ?ID?NO:1所示的序列。

一種棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因編碼的氨基酸，該氨基酸的序列是如SEQ?ID?NO:2所示的序列。

一種棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列是如SEQ?ID?NO:2所示的序列。

一種棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因在提高植物抗旱性、耐鹽性中的應(yīng)用。

本發(fā)明從已經(jīng)構(gòu)建的壺瓶棗（Ziziphus?jujuba?Mill?hupingzao）結(jié)果枝（即棗吊）cDNA文庫中篩選到棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因的全序列，將其命名為Zj2-CP（Ziziphus?jujube?2-cys?peroxiredoxin）。生物信息學(xué)分析表明Zj2-CP基因的cDNA序列全長為834bp，編碼277個氨基酸，分子量為30.65KD，理論等電點為8.95，CG含量為45.68%，不穩(wěn)定系數(shù)為41.56，脂溶指數(shù)為87.29，疏水性平均值為-0.12。通過分析得出該基因編碼的蛋白為膜外非分泌性蛋白，該基因編碼的蛋白與已知物種2-半胱氨酸氧化還原酶基因編碼蛋白的同源性為82%—99%。

根據(jù)棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因的cDNA編碼的序列，設(shè)計帶有限制性內(nèi)切酶Sma?I和Sal?I酶切位點的特異性引物，Zj2-CP基因的上游引物W2的序列為：5'-ATAGTCGACAATGGCTTGCTCTG-3'，含有Sal?I限制性酶切位點；Zj2-CP基因的下游引物W3的序列為：5'-ATCCCGGGTTATTGCTGCAAAG-3'，含有Sma?I限制性酶切位點。設(shè)計的引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sma?I和Sal?I修飾后連接于植物表達(dá)載體PEZR(K)-LNY上，經(jīng)過熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)卡那霉素抗性篩選獲得陽性菌落，用堿裂解法提取陽性菌落質(zhì)粒，經(jīng)酶切，測序表明植物表達(dá)載體PEZR(K)-LNY-Zj2-CP構(gòu)建成功。

通過凍融法將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒PEZR(K)-LNY-Zj2-CP轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404的感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)卡那霉素抗性篩選獲得陽性菌落，經(jīng)含卡納霉素的LB平板篩選轉(zhuǎn)化子、PCR鑒定、酶切鑒定、測序證明工程菌PEZR(K)-LNY-Zj2-CP構(gòu)建成功。農(nóng)桿菌介導(dǎo)Zj2-CP基因轉(zhuǎn)化擬南芥，經(jīng)卡那霉素抗性篩選獲得含有目的基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，通過激光共聚焦觀察分析表明棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥的不同組織部位，根、莖、葉中均有不同程度的表達(dá)。

將轉(zhuǎn)Zj2-CP基因擬南芥純合株系的種子和野生型擬南芥種子均播種在加不同濃度NaCl的1/2MS培養(yǎng)基上，對轉(zhuǎn)Zj2-CP基因擬南芥純合株系的種子進(jìn)行耐鹽性評價，觀察其生長狀況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Zj2-CP基因擬南芥植株在鹽脅迫處理下長勢和根系明顯好于野生型擬南芥植株。將轉(zhuǎn)Zj2-CP基因擬南芥植株和野生型（WT）擬南芥植株進(jìn)行耐鹽、耐旱脅迫處理，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Zj2-CP基因擬南芥植株耐鹽、耐旱性明顯提高。